Immunmodulerande metaboliter är en viktig del av tumörmikromiljön (TME), men med några få undantag förblir deras identiteter i stort sett okända. Här analyserade vi tumörer och T-celler från tumörer och ascites hos patienter med höggradig serös karcinom (HGSC) för att avslöja metabolomet i dessa olika TME-kompartment. Ascites och tumörceller har omfattande skillnader i metaboliter. Jämfört med ascites är de tumörinfiltrerande T-cellerna signifikant berikade med 1-metylnikotinamid (MNA). Även om nivån av MNA i T-celler är förhöjd, är uttrycket av nikotinamid-N-metyltransferas (ett enzym som katalyserar överföringen av metylgrupper från S-adenosylmetionin till nikotinamid) begränsat till fibroblaster och tumörceller. Funktionellt inducerar MNA T-celler att utsöndra det tumörfrämjande cytokinet tumörnekrosfaktor alfa. Därför bidrar TME-deriverad MNA till immunregleringen av T-celler och representerar ett potentiellt immunterapimål för behandling av mänsklig cancer.
Tumörderiverade metaboliter kan ha en djupgående hämmande effekt på antitumörimmunitet, och fler och fler bevis visar att de också kan fungera som en viktig drivkraft för sjukdomsprogression (1). Förutom Warburg-effekten har nyligen arbete börjat karakterisera tumörcellers metaboliska tillstånd och dess samband med immuntillståndet i tumörmikromiljön (TME). Studier på musmodeller och humana T-celler har visat att glutaminmetabolism (2), oxidativ metabolism (3) och glukosmetabolism (4) kan verka oberoende av varandra på olika immuncellsundergrupper. Flera metaboliter i dessa vägar hämmar T-cellernas antitumörfunktion. Det har bevisats att blockaden av koenzymet tetrahydrobiopterin (BH4) kan skada proliferationen av T-celler, och ökningen av BH4 i kroppen kan förstärka det antitumörimmunsvar som medieras av CD4 och CD8. Dessutom kan den immunsuppressiva effekten av kynurenin återställas genom administrering av BH4 (5). Vid isocitratdehydrogenas (IDH)-mutantglioblastom hämmar utsöndringen av enantiometaboliskt (R)-2-hydroxiglutarat (R-2-HG) T-cellsaktivering, proliferation och cytolysaktivitet (6). Nyligen har det visats att metylglyoxal, en biprodukt av glykolys, produceras av suppressorceller av myeloid ursprung, och T-cellsöverföring av metylglyoxal kan hämma effektor-T-cellsfunktion. Vid behandling kan neutralisering av metylglyoxal övervinna aktiviteten hos myeloid-deriverade suppressorceller (MDSC) och synergistiskt förbättra checkpoint-blockadbehandling i musmodeller (7). Dessa studier betonar tillsammans den viktiga rollen för TME-deriverade metaboliter i regleringen av T-cellsfunktion och aktivitet.
T-cellsdysfunktion har rapporterats i stor utsträckning vid äggstockscancer (8). Detta beror delvis på de metaboliska egenskaper som är inneboende i hypoxi och onormal tumörvaskulatur (9), vilket resulterar i omvandling av glukos och tryptofan till biprodukter som mjölksyra och kynurenin. Överdriven extracellulär laktat minskar produktionen av interferon-γ (IFN-γ) och driver differentieringen av myelosuppressiva undergrupper (10, 11). Konsumtionen av tryptofan hämmar direkt T-cellsproliferation och hämmar T-cellsreceptorsignalering (12-14). Trots dessa observationer utfördes mycket arbete kring immunmetabolism i in vitro T-cellskultur med optimerade medier, eller begränsades till homologa musmodeller in vivo, vilket inte helt återspeglar heterogeniteten hos mänskliga cancerformer och fysiologisk makro- och mikromiljö.
Ett vanligt kännetecken för äggstockscancer är peritoneal spridning och uppkomsten av ascites. Ansamling av cellvätska i ascites är förknippad med avancerad sjukdom och dålig prognos (15). Enligt rapporter är denna unika avdelning hypoxisk, har höga nivåer av vaskulär endoteltillväxtfaktor (VEGF) och indoleamin 2,3-dioxygenas (IDO), och infiltreras av T-reglerande celler och myeloidhämmande celler (15-18). Den metaboliska miljön för ascites kan skilja sig från själva tumörens, så omprogrammeringen av T-celler i peritonealutrymmet är oklar. Dessutom kan de viktigaste skillnaderna och heterogeniteten mellan ascites och metaboliter som finns i tumörmiljön hindra infiltrationen av immunceller och deras funktion på tumörer, och ytterligare forskning behövs.
För att lösa dessa problem utformade vi en känslig cellseparations- och vätskekromatografi-tandemmasspektrometrimetod (LC-MS/MS) för att studera olika celltyper (inklusive CD4+ och CD8+ T-celler) samt inom och mellan tumörer. Dess metaboliter spänner över celler i samma ascites- och tumörmiljö som patienten. Vi använder denna metod i samband med högdimensionell flödescytometri och encellig RNA-sekvensering (scRNA-seq) för att ge en mycket upplöst bild av den metaboliska statusen hos dessa nyckelpopulationer. Denna metod avslöjade en signifikant ökning av nivån av 1-metylnikotinamid (MNA) i tumör-T-celler, och in vitro-experiment visade att den immunmodulerande effekten av MNA på T-cellsfunktionen tidigare var okänd. I allmänhet avslöjar denna metod de ömsesidiga metaboliska interaktionerna mellan tumörer och immunceller, och ger unika insikter i immunregleringsmetaboliter, vilket kan vara användbart för behandling av T-cellsbaserad immunterapi för äggstockscancer.
Vi använde högdimensionell flödescytometri för att samtidigt kvantifiera glukosupptag [2-(N-(7-nitrofenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglukos (2-NBDG) och mitokondriell aktivitet [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) är typiska markörer som sida vid sida skiljer immunceller och tumörcellspopulationer (tabell S2 och figur S1A). Denna analys visade att ascites och tumörceller har högre glukosupptagsnivåer jämfört med T-celler, men mindre skillnader i mitokondriell aktivitet. Det genomsnittliga glukosupptaget för tumörceller [CD45-EpCAM (EpCAM)+] är tre till fyra gånger så stort som för T-celler, och det genomsnittliga glukosupptaget för CD4+ T-celler är 1,2 gånger så stort som för CD8+ T-celler, vilket indikerar att tumörinfiltrerande lymfocyter (TIL) har olika metaboliska krav även i samma TME (figur 1A). Däremot liknar den mitokondrielle aktiviteten i tumörceller den hos CD4+ T-celler, och den mitokondrielle aktiviteten hos båda celltyperna är högre än den hos CD8+ T-celler (Figur 1B). Generellt sett visar dessa resultat den metaboliska nivån. Den metaboliska aktiviteten hos tumörceller är högre än den hos CD4+ T-celler, och den metaboliska aktiviteten hos CD4+ T-celler är högre än den hos CD8+ T-celler. Trots dessa effekter över celltyper finns det ingen konsekvent skillnad i den metaboliska statusen hos CD4+ och CD8+ T-celler eller deras relativa andelar i ascites jämfört med tumörer (Figur 1C). Däremot ökade andelen EpCAM+ celler i tumören i CD45-cellfraktionen jämfört med ascites (Figur 1D). Vi observerade också en tydlig metabolisk skillnad mellan EpCAM+ och EpCAM- cellkomponenter. EpCAM+ (tumör) celler har högre glukosupptag och mitokondriell aktivitet än EpCAM- celler, vilket är mycket högre än den metaboliska aktiviteten hos fibroblaster i tumörceller i TME (Figur 1, E och F).
(A och B) Medianfluorescensintensitet (MFI) för glukosupptag (2-NBDG) (A) och mitokondriell aktivitet hos CD4+ T-celler (MitoTracker mörkröd) (B) Representativa grafer (vänster) och tabelldata (höger), CD8+ T-celler och EpCAM+ CD45-tumörceller från ascites och tumör. (C) Förhållandet mellan CD4+ och CD8+ celler (av CD3+ T-celler) i ascites och tumör. (D) Andel EpCAM+ tumörceller i ascites och tumör (CD45−). (E och F) EpCAM + CD45-tumör och EpCAM-CD45-matrix glukosupptag (2-NBDG) (E) och mitokondriell aktivitet (MitoTracker mörkröd) (F) Representativa grafer (vänster) och tabelldata (höger) Ascites och tumörceller. (G) Representativa grafer över CD25-, CD137- och PD1-uttryck med flödescytometri. (H och I) CD25-, CD137- och PD1-uttryck på CD4+ T-celler (H) och CD8+ T-celler (I). (J och K) Naiva fenotyper, centralt minne (Tcm), effektor- (Teff) och effektorminne (Tem) baserade på uttrycket av CCR7 och CD45RO. Representativa bilder (vänster) och tabelldata (höger) av CD4+ T-celler (J) och CD8+ T-celler (K) i ascites och tumörer. P-värden bestämda med parat t-test (*P<0,05, **P<0,01 och ***P<0,001). Linjen representerar matchade patienter (n = 6). FMO, fluorescens minus ett; MFI, median fluorescensintensitet.
Vidare analys avslöjade andra signifikanta skillnader mellan den fenotypiska statusen för T-celler med hög upplösning. Aktiverat minne (Figur 1, G till I) och effektorminne (Figur 1, J och K) är mycket vanligare i tumörer än ascites (andel CD3+ T-celler). På liknande sätt visade analys av fenotypen genom uttryck av aktiveringsmarkörer (CD25 och CD137) och utarmningsmarkörer [programmerad celldödsprotein 1 (PD1)] att även om de metaboliska egenskaperna hos dessa populationer är olika (Figur S1, B till E), observerades inga signifikanta metaboliska skillnader konsekvent mellan naiva, effektor- eller minnesundergrupper (Figur S1, F till I). Dessa resultat bekräftades med hjälp av maskininlärningsmetoder för att automatiskt tilldela cellfenotyper (21), vilket ytterligare avslöjade närvaron av ett stort antal benmärgsceller (CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+) i patientens ascites (Figur S2A). Bland alla identifierade celltyper uppvisade denna myeloidcellpopulation det högsta glukosupptaget och mitokondrieaktiviteten (Figur S2, B till G). Dessa resultat belyser de starka metaboliska skillnaderna mellan de olika celltyperna som finns i ascites och tumörer hos patienter med högst blodsockernivå (HGSC).
Den största utmaningen i att förstå de metabonomiska egenskaperna hos TIL är behovet av att isolera T-cellsprover av tillräcklig renhet, kvalitet och kvantitet från tumörer. Nyligen genomförda studier har visat att sorterings- och kulberikningsmetoder baserade på flödescytometri kan leda till förändringar i cellulära metabolitprofiler (22-24). För att övervinna detta problem optimerade vi kulberikningsmetoden för att isolera och isolera TIL från kirurgiskt resekterad mänsklig äggstockscancer före analys med LC-MS/MS (se Material och metoder; Figur 2A). För att bedöma den övergripande effekten av detta protokoll på metabolitförändringar jämförde vi metabolitprofilerna hos T-celler aktiverade av friska donatorer efter ovanstående kulseparationssteg med celler som inte kulseparerades utan förblev på is. Denna kvalitetskontrollanalys fann att det finns en hög korrelation mellan dessa två tillstånd (r = 0,77), och den tekniska repeterbarheten för gruppen av 86 metaboliter har hög repeterbarhet (Figur 2B). Därför kan dessa metoder utföra noggrann metabolitanalys i celler som genomgår celltypsanrikning, vilket ger den första högupplösta plattformen för att identifiera specifika metaboliter i HGSC, vilket gör det möjligt för människor att få en djupare förståelse av cellspecificitet och sexuell metabolism.
(A) Schematiskt diagram över anrikning av magnetiska kulor. Före analys med LC-MS/MS genomgår cellerna tre omgångar i följd av anrikning av magnetiska kulor eller förblir på is. (B) Effekten av anrikningstyp på förekomsten av metaboliter. Medelvärdet av tre mätningar för varje anrikningstyp ± SE. Den grå linjen representerar ett 1:1-förhållande. Intraklasskorrelationen (ICC) av upprepade mätningar visas i axeletiketten. NAD, nikotinamid-adenin-dinukleotid. (C) Schematiskt diagram över arbetsflödet för patientmetabolitanalys. Ascites eller tumörer samlas in från patienter och kryokonserveras. En liten del av varje prov analyserades med flödescytometri, medan de återstående proverna genomgick tre omgångar av anrikning för CD4+-, CD8+- och CD45--celler. Dessa cellfraktioner analyserades med LC-MS/MS. (D) Värmekarta över standardiserad metabolitförekomst. Dendrogrammet representerar Wards klustring av euklidiska avstånd mellan prover. (E) Principalkomponentanalys (PCA) av provets metabolitkarta, som visar tre replikat av varje prov, där prover från samma patient är sammankopplade med en linje. (F) PCA för provets metabolitprofil betingad med patienten (dvs. med partiell redundans); provtypen begränsas av det konvexa skalet. PC1, huvudkomponent 1; PC2, huvudkomponent 2.
Därefter tillämpade vi denna anrikningsmetod för att analysera 99 metaboliter i CD4+-, CD8+- och CD45-cellfraktionerna i primär ascites och tumörer hos sex HGSC-patienter (Figur 2C, Figur S3A och Tabell S3 och S4). Den aktuella populationen står för 2% till 70% av det ursprungliga stora urvalet av levande celler, och andelen celler varierar kraftigt mellan patienter. Efter att ha separerat pärlorna står den anrikade fraktionen av intresse (CD4+, CD8+ eller CD45-) för mer än 85% av alla levande celler i provet i genomsnitt. Denna anrikningsmetod gör det möjligt för oss att analysera cellpopulationer från metabolismen av mänsklig tumörvävnad, vilket är omöjligt att göra från stora prover. Med hjälp av detta protokoll bestämde vi att l-kynurenin och adenosin, dessa två välkarakteriserade immunsuppressiva metaboliter, var förhöjda i tumör-T-celler eller tumörceller (Figur S3, B och C). Därför visar dessa resultat på noggrannheten och förmågan hos vår cellseparations- och masspektrometriteknik att hitta biologiskt viktiga metaboliter i patientvävnader.
Vår analys visade också en stark metabolisk separation av celltyper inom och mellan patienter (Figur 2D och Figur S4A). I ​​synnerhet, jämfört med andra patienter, uppvisade patient 70 olika metaboliska egenskaper (Figur 2E och Figur S4B), vilket indikerar att det kan finnas betydande metabolisk heterogenitet mellan patienter. Det är värt att notera att jämfört med andra patienter (1,2 till 2 liter; Tabell S1) var den totala mängden ascites som samlades in hos patient 70 (80 ml) mindre. Kontrollen av heterogenitet mellan patienter under principal component analysis (till exempel med hjälp av partiell redundansanalys) visar konsekventa förändringar mellan celltyper, och celltyperna och/eller mikromiljön är tydligt aggregerade enligt metabolitprofilen (Figur 2F). Analysen av enskilda metaboliter betonade dessa effekter och avslöjade signifikanta skillnader mellan celltyper och mikromiljö. Det är värt att notera att den mest extrema skillnaden som observerats är MNA, som vanligtvis är anrikad i CD45-celler och i CD4+ och CD8+ celler som infiltrerar tumören (Figur 3A). För CD4+-celler är denna effekt mest uppenbar, och MNA i CD8+-celler verkar också vara starkt påverkad av miljön. Detta är dock inte viktigt, eftersom endast tre av de sex patienterna kan utvärderas för tumör-CD8+-poäng. Förutom MNA, i olika typer av celler i ascites och tumörer, är andra metaboliter som är dåligt karakteriserade i TIL också differentiellt rika (figurerna S3 och S4). Därför avslöjar dessa data en lovande uppsättning immunmodulerande metaboliter för vidare forskning.
(A) Normaliserat innehåll av MNA i CD4+, CD8+ och CD45- celler från ascites och tumör. Boxdiagrammet visar medianen (linjen), interkvartilintervallet (frame hinge) och dataintervallet, upp till 1,5 gånger interkvartilintervallet (frame whisker). Som beskrivs i Patientmaterial och metoder, använd patientens limmavärde för att bestämma P-värdet (*P<0,05 och **P<0,01). (B) Schematiskt diagram över MNA-metabolism (60). Metaboliter: S-adenosyl-1-metionin; SAH, S-adenosin-1-homocystein; NA, nikotinamid; MNA, 1-metylnikotinamid; 2-PY, 1-metyl-2-pyridon-5-karboxamid; 4-PY, 1-metyl-4-pyridon-5-karboxamid; NR, nikotinamidribos; NMN, nikotinamidmononukleotid. Enzymer (grönt): NNMT, nikotinamid-N-metyltransferas; SIRT, sirtuiner; NAMPT, nikotinamidfosforibosyltransferas; AOX1, aldehydoxidas 1; NRK, nikotinamidribosidkinas; NMNAT, nikotinamidmononukleotidadenylattransferas; Pnp1, purinnukleosidfosforylas. (C) t-SNE av scRNA-sekvens av ascites (grå) och tumör (röd; n = 3 patienter). (D) NNMT-uttryck i olika cellpopulationer identifierade med scRNA-sekvens. (E) Uttryck av NNMT och AOX1 i SK-OV-3, humana embryonala njurar (HEK) 293T, T-celler och MNA-behandlade T-celler. Det vikta uttrycket visas i förhållande till SK-OV-3. Uttrycksmönstret med SEM visas (n = 6 friska donatorer). Ct-värden större än 35 anses vara odetekterbara (UD). (F) Uttryck av SLC22A1 och SLC22A2 i SK-OV-3, HEK293T, T-celler och T-celler behandlade med 8 mM MNA. Det vikta uttrycket visas i förhållande till SK-OV-3. Uttrycksmönstret med SEM visas (n = 6 friska donatorer). Ct-värden större än 35 anses vara odetekterbara (UD). (G) Cell-MNA-innehåll i aktiverade friska donator-T-celler efter 72 timmars inkubation med MNA. Uttrycksmönstret med SEM visas (n = 4 friska donatorer).
MNA produceras genom att överföra metylgruppen från S-adenosyl-1-metionin (SAM) till nikotinamid (NA) med hjälp av nikotinamid-N-metyltransferas (NNMT; figur 3B). NNMT är överuttryckt i en mängd olika humana cancerformer och är associerat med proliferation, invasion och metastasering (25-27). För att bättre förstå källan till MNA i T-celler vid TME använde vi scRNA-seq för att karakterisera uttrycket av NNMT över celltyper i ascites och tumörer hos tre HGSC-patienter (tabell S5). Analys av cirka 6 500 celler visade att NNMT-uttrycket i ascites- och tumörmiljöer var begränsat till de förmodade fibroblast- och tumörcellspopulationerna (figur 3, C och D). Det är värt att notera att det inte finns något uppenbart NNMT-uttryck i någon population som uttrycker PTPRC (CD45+) (figur 3D och figur S5A), vilket indikerar att den MNA som detekterats i metabolitspektrumet har introducerats i T-celler. Uttrycket av aldehydoxidas 1 (AOX1) omvandlar MNA till 1-metyl-2-pyridon-5-karboxamid (2-PYR) eller 1-metyl-4-pyridon-5-karboxamid (4-PYR); figur 3B) är också begränsat till populationen av fibroblaster som uttrycker COL1A1 (figur S5A), vilket tillsammans indikerar att T-celler saknar förmågan till konventionell MNA-metabolism. Uttrycksmönstret för dessa MNA-relaterade gener verifierades med hjälp av en andra oberoende celldatauppsättning från ascites från HGSC-patienter (figur S5B; n = 6) (16). Dessutom visade kvantitativ polymeraskedjereaktionsanalys (qPCR) av friska donator-T-celler behandlade med MNA att NNMT eller AOX1 nästan inte uttrycktes i jämförelse med kontroll SK-OV-3-äggstockstumörceller (figur 3E). Dessa oväntade resultat indikerar att MNA kan utsöndras från fibroblaster eller tumörer till intilliggande T-celler i TME.
Även om kandidaterna inkluderar familjen av organiska katjontransportörer 1 till 3 (OCT1, OCT2 och OCT3) kodade av den lösliga bärarfamiljen 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 och SLC22A3), är de potentiella transportörerna av MNA fortfarande odefinierade (28). QPCR av mRNA från friska donator-T-celler visade låga uttrycksnivåer av SLC22A1 men odetekterbara nivåer av SLC22A2, vilket bekräftade att det tidigare hade rapporterats i litteraturen (Figur 3F) (29). Däremot uttryckte SK-OV-3-äggstockstumörcellinjen höga nivåer av båda transportörerna (Figur 3F).
För att testa möjligheten att T-celler har förmågan att absorbera främmande MNA odlades friska donator-T-celler i 72 timmar i närvaro av olika koncentrationer av MNA. I frånvaro av exogent MNA kan det cellulära innehållet av MNA inte detekteras (Figur 3G). Aktiverade T-celler behandlade med exogent MNA visade dock en dosberoende ökning av MNA-innehållet i cellerna, upp till 6 mM MNA (Figur 3G). Detta resultat indikerar att trots den låga nivån av transportöruttryck och avsaknaden av det huvudsakliga enzymet som ansvarar för intracellulär MNA-metabolism, kan TIL fortfarande ta upp MNA.
Spektrumet av metaboliter i patienters T-celler och in vitro-MNA-absorptionsexperiment ökar möjligheten att cancerassocierade fibroblaster (CAF) utsöndrar MNA och att tumörceller kan reglera fenotypen och funktionen av TIL. För att bestämma effekten av MNA på T-celler aktiverades friska donator-T-celler in vitro i närvaro eller frånvaro av MNA, och deras proliferation och cytokinproduktion utvärderades. Efter 7 dagar med tillsats av MNA vid den högsta dosen minskade populationsfördubblingen måttligt, medan livskraften bibehölls vid alla doser (Figur 4A). Dessutom resulterade behandling av exogent MNA i en ökning av andelen CD4+ och CD8+ T-celler som uttryckte tumörnekrosfaktor-α (TNFα; Figur 4B). Däremot minskade den intracellulära produktionen av IFN-γ signifikant i CD4+ T-celler, men inte i CD8+ T-celler, och det fanns ingen signifikant förändring i interleukin 2 (IL-2; Figur 4, C och D). Därför visade enzymlänkad immunosorbentanalys (ELISA) av supernatanter från dessa MNA-behandlade T-cellskulturer en signifikant ökning av TNFα, en minskning av IFN-γ och ingen förändring av IL-2 (Figur 4, E till G). Minskningen av IFN-γ indikerar att MNA kan spela en roll i att hämma T-cellernas antitumöraktivitet. För att simulera effekten av MNA på T-cellsmedierad cytotoxicitet produceras chimära antigenreceptor-T-celler (FRα-CAR-T) som riktar sig mot folatreceptor α och CAR-T (GFP) reglerade av grönt fluorescerande protein (GFP)-CAR-T-celler av friska perifera blodmononukleära celler (PBMC) från donatorer. CAR-T-celler odlades i 24 timmar i närvaro av MNA och samodlades sedan med humana SK-OV-3-äggstockstumörceller som uttrycker folatreceptor α i ett effektor-till-mål-förhållande på 10:1. MNA-behandling resulterade i en signifikant minskning av den dödande aktiviteten hos FRα-CAR-T-celler, vilket liknade den hos FRα-CAR-T-celler behandlade med adenosin (Figur 4H).
(A) Totalt antal livskraftiga celler och populationsfördubbling (PD) direkt från kultur på dag 7. Stapeldiagrammet representerar medelvärdet + SEM för sex friska donatorer. Representerar data från minst n = 3 oberoende experiment. (B till D) CD3/CD28 och IL-2 användes för att aktivera T-celler vid deras respektive MNA-koncentrationer i 7 dagar. Före analys stimulerades cellerna med PMA/ionomycin med GolgiStop i 4 timmar. TNFα (B)-uttryck i T-celler. Exempelbild (vänster) och tabelldata (höger) av TNFα-uttryck i levande celler. IFN-γ (C) och IL-2 (D)-uttryck i T-celler. Uttrycket av cytokiner mättes med flödescytometri. Stapeldiagrammet representerar medelvärdet (n = 6 friska donatorer) + SEM. Använd envägsvariansanalys och upprepade mätningar (*P<0,05 och **P<0,01) för att bestämma P-värdet. Representerar data från minst n = 3 oberoende experiment. (E till G) CD3/CD28 och IL-2 användes för att aktivera T-celler vid deras respektive MNA-koncentrationer i 7 dagar. Mediet samlades in före och efter 4 timmars PMA/ionomycin-stimulering. Koncentrationerna av TNFα (E), IFN-γ (F) och IL-2 (G) mättes med ELISA. Stapeldiagrammet representerar medelvärdet (n = 5 friska donatorer) + SEM. P-värdet bestämdes med envägsvariansanalys och upprepade mätningar (*P < 0,05). Den streckade linjen indikerar detektionsgränsen för detektionen. (H) Celllysanalys. FRα-CAR-T- eller GFP-CAR-T-celler justerades med adenosin (250 μM) eller MNA (10 mM) i 24 timmar, eller lämnades obehandlade (Ctrl). Procentuell avdödning av SK-OV-3-celler mättes. P-värdet bestämdes med Welch t-test (*P < 0,5 och **P < 0,01).
För att få en mekanistisk förståelse av MNA-beroende TNFα-expressionsreglering utvärderades förändringarna i TNFα mRNA hos MNA-behandlade T-celler (Figur 5A). Friska donator-T-celler behandlade med MNA visade en tvåfaldig ökning av TNFα-transkriptionsnivåer, vilket indikerar att MNA är beroende av TNFα-transkriptionsreglering. För att undersöka denna möjliga regleringsmekanism utvärderades två kända transkriptionsfaktorer som reglerar TNFα, nämligen aktiverad T-cellskärnfaktor (NFAT) och specifikt protein 1 (Sp1), som svar på MNA-bindning till den proximala TNFα-promotorn (30). TNFα-promotorn innehåller 6 identifierade NFAT-bindningsställen och 2 Sp1-bindningsställen, som överlappar varandra vid ett ställe [-55 baspar (bp) från 5'-kapseln] (30). Kromatinimmunoprecipitation (ChIP) visade att vid behandling med MNA ökade bindningen av Sp1 till TNFα-promotorn trefaldigt. Inkorporeringen av NFAT ökade också och närmade sig betydelse (Figur 5B). Dessa data indikerar att MNA reglerar uttrycket av TNFα genom Sp1-transkription, och i mindre utsträckning uttrycket av NFAT.
(A) Jämfört med T-celler odlade utan MNA, den ökade TNFα-uttrycket i T-celler behandlade med MNA. Uttrycksmönstret med SEM visas (n = 5 friska donatorer). Representerar data från minst n = 3 oberoende experiment. (B) TNFα-promotorn från T-celler behandlade med eller utan 8 mM MNA efter att NFAT och Sp1 kombinerades med (Ctrl) och PMA/ionomycin-stimulering i 4 timmar. Immunoglobulin G (IgG) och H3 användes som negativa respektive positiva kontroller för immunoprecipitation. Kvantifieringen av ChIP visade att bindningen av Sp1 och NFAT till TNFα-promotorn i MNA-behandlade celler ökade flera gånger jämfört med kontrollen. Representerar data från minst n = 3 oberoende experiment. P-värde bestämt med multipla t-tester (*** P <0,01). (C) Jämfört med ascites från HGSC visade T-celler (icke-cytotoxiska) ökat uttryck av TNF i tumören. Färgerna representerar olika patienter. De visade cellerna har slumpmässigt samplats till 300 och jitterats för att begränsa överdragning (** Padj = 0,0076). (D) Föreslagen modell av MNA för äggstockscancer. MNA produceras i tumörceller och fibroblaster i TME och tas upp av T-celler. MNA ökar bindningen av Sp1 till TNFα-promotorn, vilket leder till ökad TNFα-transkription och TNFα-cytokinproduktion. MNA orsakar också en minskning av IFN-γ. Hämning av T-cellsfunktionen leder till minskad avdödningsförmåga och accelererad tumörtillväxt.
Enligt rapporter har TNFα både fram- och bakberoende antitumör- och antitumöreffekter, men det har en välkänd roll i att främja tillväxt och metastasering av äggstockscancer (31-33). Enligt rapporter är koncentrationen av TNFα i ascites och tumörvävnader hos patienter med äggstockscancer högre än i godartade vävnader (34-36). Mekaniskt sett kan TNFα reglera aktiveringen, funktionen och proliferationen av vita blodkroppar och förändra fenotypen hos cancerceller (37, 38). I överensstämmelse med dessa fynd visade differentiell genuttrycksanalys att TNF var signifikant uppreglerad i T-celler i tumörvävnader jämfört med ascites (Figur 5C). Ökningen av TNF-uttryck var endast tydlig i T-cellspopulationer med en icke-cytotoxisk fenotyp (Figur S5A). Sammanfattningsvis stöder dessa data uppfattningen att MNA har dubbla immunsuppressiva och tumörfrämjande effekter vid HGSC.
Fluorescerande märkning baserad på flödescytometri har blivit den huvudsakliga metoden för att studera TIL-metabolism. Dessa studier har visat att murin och human TIL, jämfört med perifera blodlymfocyter eller T-celler från sekundära lymfoida organ, har en högre tendens att ta upp glukos (4, 39) och en gradvis förlust av mitokondriefunktion (19, 40). Även om vi har observerat liknande resultat i denna studie, är den viktigaste utvecklingen att jämföra metabolismen hos tumörceller och TIL från samma resekerade tumörvävnad. I överensstämmelse med några av dessa tidigare rapporter har tumörceller (CD45-EpCAM+) från ascites och tumörer högre glukosupptag än CD8+ och CD4+ T-celler, vilket stöder att det höga glukosupptaget hos tumörceller kan jämföras med T-celler. Konceptet med T-cellskonkurrens. TME. Tumörcellernas mitokondrieaktivitet är dock högre än CD8+ T-cellernas, men mitokondrieaktiviteten liknar den hos CD4+ T-cellerna. Dessa resultat förstärker det framväxande temat att oxidativ metabolism är viktig för tumörceller (41, 42). De antyder också att CD8+ T-celler kan vara mer mottagliga för oxidativ dysfunktion än CD4+ T-celler, eller att CD4+ T-celler kan använda andra kolkällor än glukos för att upprätthålla mitokondriell aktivitet (43, 44). Det bör noteras att vi inte observerade någon skillnad i glukosupptag eller mitokondriell aktivitet mellan CD4+ T-effektorer, T-effektorminne och T-centrala minnesceller i ascites. På liknande sätt har differentieringstillståndet för CD8+ T-celler i tumörer ingenting att göra med förändringar i glukosupptag, vilket belyser den signifikanta skillnaden mellan T-celler odlade in vitro och human TIL in vivo (22). Dessa observationer bekräftades också genom användning av opartisk automatisk cellpopulationsallokering, vilket vidare avslöjade att CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+ celler med högre glukosupptag och mitokondriell aktivitet än tumörceller är vanliga men har en metaboliskt aktiv cellpopulation. Denna population kan representera den förmodade subpopulationen av myeloidsuppressorceller eller plasmacytoida dendritiska celler som identifierats i scRNA-seq-analysen. Även om båda dessa har rapporterats i mänskliga äggstockstumörer [45], behöver de fortfarande beskrivas ytterligare. Ytterligare arbete är att beskriva denna myeloida subpopulation.
Även om flödescytometribaserade metoder kan klargöra de allmänna skillnaderna i glukos- och oxidativ metabolism mellan celltyper, har de exakta metaboliterna som produceras av glukos eller andra kolkällor för mitokondriemetabolism i TME ännu inte fastställts. Att tilldela närvaron eller frånvaron av metaboliter till en given TIL-subgrupp kräver rening av cellpopulationen från den exciderade vävnaden. Därför kan vår cellanrikningsmetod i kombination med masspektrometri ge insikter i de metaboliter som är differentiellt anrikade i T-celler och tumörcellspopulationer i matchande patientprover. Även om denna metod har fördelar jämfört med fluorescensaktiverad cellsortering, kan vissa metabolitbibliotek påverkas på grund av inneboende stabilitet och/eller snabb omsättningshastighet (22). Ändå kunde vår metod identifiera två erkända immunsuppressiva metaboliter, adenosin och kynurenin, eftersom de varierar kraftigt mellan provtyper.
Vår metabonomiska analys av tumörer och TIL-subtyper ger mer insikt i metaboliternas roll i ovariell TME. För det första, med hjälp av flödescytometri, fastställde vi att det inte fanns någon skillnad i mitokondriell aktivitet mellan tumörer och CD4+ T-celler. LC-MS/MS-analys avslöjade dock signifikanta förändringar i förekomsten av metaboliter bland dessa populationer, vilket indikerar att slutsatser om TIL-metabolism och dess övergripande metaboliska aktivitet kräver noggrann tolkning. För det andra är MNA den metabolit med störst skillnad mellan CD45-celler och T-celler i ascites, inte i tumörer. Därför kan kompartmentalisering och tumörlokalisering ha olika effekter på TIL-metabolism, vilket belyser den möjliga heterogeniteten i en given mikromiljö. För det tredje är uttrycket av det MNA-producerande enzymet NNMT huvudsakligen begränsat till CAF, vilket är tumörceller i mindre utsträckning, men detekterbara MNA-nivåer observeras i tumörderiverade T-celler. Överuttrycket av NNMT i ovariell CAF har en känd cancerfrämjande effekt, delvis på grund av främjandet av CAF-metabolism, tumörinvasion och metastasering (27). Även om den totala nivån av TIL är måttlig, är uttrycket av NNMT i CAF nära besläktat med den mesenkymala subtypen av Cancer Genome Atlas (TCGA), vilken är associerad med dålig prognos (27, 46, 47). Slutligen är uttrycket av enzymet AOX1 som ansvarar för MNA-nedbrytning också begränsat till CAF-populationen, vilket indikerar att T-celler saknar förmågan att metabolisera MNA. Dessa resultat stöder idén att även om ytterligare arbete behövs för att verifiera detta fynd, kan höga nivåer av MNA i T-celler indikera närvaron av en immunsuppressiv CAF-mikromiljö.
Med tanke på den låga uttrycksnivån av MNA-transportörer och de odetekterbara nivåerna av viktiga proteiner involverade i MNA-metabolism, är närvaron av MNA i T-celler oväntad. Varken NNMT eller AOX1 kunde detekteras genom scRNA-seq-analys och riktad qPCR av två oberoende kohorter. Dessa resultat indikerar att MNA inte syntetiseras av T-celler, utan absorberas från omgivande TME. In vitro-experiment visar att T-celler tenderar att ackumulera exogent MNA.
Våra in vitro-studier har visat att exogent MNA inducerar uttrycket av TNFα i T-celler och förstärker bindningen av Sp1 till TNFα-promotorn. Även om TNFα har både antitumör- och antitumörfunktioner, kan TNFα vid äggstockscancer främja tillväxten av äggstockscancer (31-33). Neutralisering av TNFα i äggstockstumörcellskultur eller eliminering av TNFα-signal i musmodeller kan förbättra TNFα-medierad inflammatorisk cytokinproduktion och hämma tumörtillväxt (32, 35). Därför kan TME-deriverad MNA i detta fall fungera som en proinflammatorisk metabolit genom en TNFα-beroende mekanism genom den autokrina slingan, och därigenom främja uppkomsten och spridningen av äggstockscancer (31). Baserat på denna möjlighet studeras TNFα-blockad som ett potentiellt terapeutiskt medel för äggstockscancer (37, 48, 49). Dessutom försämrar MNA cytotoxiciteten hos CAR-T-celler till äggstockstumörceller, vilket ger ytterligare bevis för MNA-medierad immunsuppression. Sammantaget tyder dessa resultat på en modell där tumörer och CAF-celler utsöndrar MNA i extracellulär TME. Genom (i) TNF-inducerad stimulering av äggstockscancertillväxt och (ii) MNA-inducerad hämning av T-cells cytotoxisk aktivitet kan detta ha en dubbel tumöreffekt (Figur 5D).
Sammanfattningsvis, genom att tillämpa en kombination av snabb cellanrikning, encellssekvensering och metabolisk profilering, avslöjade denna studie de enorma immunometabolomiska skillnaderna mellan tumörer och ascitesceller hos patienter med högcellscancer (HGSC). Denna omfattande analys visade att det finns skillnader i glukosupptag och mitokondriell aktivitet mellan T-celler, och identifierade MNA som en icke-cellig autonom immunreglerande metabolit. Dessa data har en inverkan på hur TME påverkar T-cellsmetabolismen i mänskliga cancerformer. Även om direkt konkurrens om näringsämnen mellan T-celler och cancerceller har rapporterats, kan metaboliter också fungera som indirekta regulatorer för att främja tumörprogression och eventuellt undertrycka endogena immunsvar. En ytterligare beskrivning av den funktionella rollen hos dessa reglerande metaboliter kan öppna upp alternativa strategier för att förbättra det antitumöriska immunsvaret.
Patientprover och kliniska data erhölls genom BC:s tumörvävnadsförråd för cancer, certifierat av Canadian Tissue Repository Network. Enligt protokollet som godkänts av BC Cancer Research Ethics Committee och University of British Columbia (H07-00463) erhölls alla patienters prover och kliniska data antingen skriftligt informerat samtycke eller formellt avstod från sitt samtycke. Proverna lagras i den certifierade biobanken (BRC-00290). Detaljerade patientkarakteristika visas i tabellerna S1 och S5. För kryokonservering används en skalpell för att mekaniskt bryta ner patientens tumörprov och sedan trycka det genom ett 100-mikronfilter för att erhålla en encellssuspension. Patientens ascites centrifugerades vid 1500 rpm i 10 minuter vid 4 °C för att pelletera cellerna och avlägsna supernatanten. Celler erhållna från tumörer och ascites kryokonserverades i 50 % värmeinaktiverat humant AB-serum (Sigma-Aldrich), 40 % RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) och 10 % dimetylsulfoxid. Dessa konserverade encellssuspensioner tinades och användes för metabolomik och metabolitbestämning som beskrivs nedan.
Det kompletta mediet består av 0,22 μm filtrerad 50:50 kompletterad RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2,05 mM l-glutamin (Thermo Fisher Scientific) kompletterad med 10 % värmeinaktiverat humant AB-serum (Sigma-Aldrich), 12,5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamin (Thermo Fisher Scientific), 1 x penicillinstreptomycinlösning (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) och 50 μMB merkaptoetanol. AimV (Invitrogen) kompletteras med 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) och 2 mM l-glutamin (Thermo Fisher Scientific). Flödescytometerns färgbuffert bestod av 0,22 μm filtrerad fosfatbuffrad saltlösning (PBS; Invitrogen) kompletterad med 3 % värmeinaktiverat AB-humant serum (Sigma). Cellanrikningsbufferten består av 0,22 μm filtrerad PBS och kompletterad med 0,5 % värmeinaktiverat humant AB-serum (Sigma-Aldrich).
I 37 °C komplett medium färgades cellerna med 10 nM MT DR och 100 μM 2-NBDG i 30 minuter. Därefter färgades cellerna med viabilitetsfärgämnet eF506 vid 4 °C i 15 minuter. Resuspendera cellerna i FC Block (eBioscience) och Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), späd ut i flödescytometrisk färgbuffert (enligt tillverkarens instruktioner) och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur. Färga cellerna med en uppsättning antikroppar (tabell S2) i flödescytometrisk färgbuffert vid 4 °C i 20 minuter. Resuspendera cellerna i flödescytometrisk färgbuffert (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R konfiguration) före analys. Använd SpectroFlo och FlowJo V10 för att analysera cellantaldata och använd GraphPad Prism 8 för att skapa data. Medianfluorescensintensiteten (MFI) för 2-NBDG och MT DR log-normaliserades, och sedan användes ett parat t-test för statistisk analys för att ta hänsyn till matchade patienter. Ta bort alla populationer med färre än 40 händelser från analysen; ange ett MFI-värde på 1 för eventuella negativa värden innan statistisk analys och datavisualisering utförs.
För att komplettera den manuella grindningsstrategin i ovanstående processpanel använde vi den fullständiga annoteringen av formbegränsningsträdet (FAUST) (21) för att automatiskt tilldela celler till populationen efter att döda celler eliminerats i FlowJo. Vi hanterar manuellt utdata för att slå samman populationer som verkar vara felallokerade (kombinera PD1+ med PD1-tumörceller) och behållna populationer. Varje prov innehåller i genomsnitt mer än 2 % celler, för totalt 11 populationer.
Ficoll-gradientdensitetscentrifugering användes för att separera PBMC från leukocytseparationsprodukter (STEMCELL Technologies). CD8+ T-celler isolerades från PBMC med CD8 MicroBeads (Miltenyi) och expanderades i komplett medium med TransAct (Miltenyi) i 2 veckor enligt tillverkarens instruktioner. Cellerna fick stå i 5 dagar i komplett medium innehållande IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) och stimulerades sedan på nytt med TransAct. På dag 7, enligt tillverkarens instruktioner, användes humana CD45 MicroBeads (Miltenyi) för att anrika cellerna i tre på varandra följande omgångar. Cellerna alikvoterades för flödescytometrianalys (enligt beskrivningen ovan), och en miljon celler alikvoterades tre gånger för LC-MS/MS-analys. Proverna bearbetades med LC-MS/MS enligt beskrivningen nedan. Vi uppskattade det saknade metabolitvärdet med ett jontal på 1 000. Varje prov normaliseras med det totala jonantalet (TIC), logaritmiskt konverteras och normaliseras automatiskt i MetaboAnalystR före analys.
Encellsuspensionen från varje patient tinades och filtrerades genom ett 40 μm filter till komplett medium (enligt tillverkarens protokoll). Enligt tillverkarens protokoll användes tre på varandra följande omgångar av positiv selektion genom magnetisk kulseparation med MicroBeads (Miltenyi) för att anrika proverna för CD8+, CD4+ och CD45- celler (på is). Kort sagt, cellerna resuspenderas i cellanrikningsbuffert (enligt beskrivningen ovan) och räknas. Cellerna inkuberades med humana CD8-kulor, humana CD4-kulor eller humana CD45-kulor (Miltenyi) vid 4°C i 15 minuter och tvättades sedan med cellanrikningsbuffert. Provet passerar genom LS-kolonnen (Miltenyi), och de positiva och negativa fraktionerna samlas in. För att minska varaktigheten och maximera cellåterhämtningssteget används CD8-fraktionen sedan för den andra omgången av CD4+-anrikning, och CD4-fraktionen används för den efterföljande CD45-anrikningen. Förvara lösningen på is under hela separationsprocessen.
För att förbereda prover för metabolitanalys tvättades cellerna en gång med iskall saltlösning, och 1 ml 80 % metanol tillsattes till varje prov, virvlades sedan och frystes snabbt i flytande kväve. Proverna utsattes för tre frys- och upptiningscykler och centrifugerades vid 14 000 rpm i 15 minuter vid 4 °C. Supernatanten innehållande metaboliterna indunstades tills den var torr. Metaboliterna löstes upp igen i 50 μl 0,03 % myrsyra, virvlades för att blandas och centrifugerades sedan för att avlägsna skräp.
Extrahera metaboliter enligt beskrivningen ovan. Överför supernatanten till en flaska med högpresterande vätskekromatografi för metabolomikforskning. Använd ett slumpmässigt behandlingsprotokoll för att behandla varje prov med ett liknande antal celler för att förhindra batcheffekter. Vi utförde en kvalitativ bedömning av globala metaboliter som tidigare publicerats på AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50). Kromatografisk analys och toppareaintegration utfördes med hjälp av MultiQuant version 2.1-programvara (Applied Biosystems SCIEX).
Ett jonantal på 1000 användes för att uppskatta det saknade metabolitvärdet, och TIC för varje prov användes för att beräkna den normaliserade topparean för varje detekterad metabolit för att korrigera för förändringar som introducerats av den instrumentella analysen från provbearbetningen. Efter att TIC har normaliserats används MetaboAnalystR(51) (standardparameter) för logaritmisk konvertering och automatisk normlinjeskalning. Vi använde PCA med vegan R-paketet för att utföra explorativ analys av metabolomskillnader mellan provtyper och använde partiell redundansanalys för att analysera patienter. Vi använde Ward-metoden för att konstruera ett värmekart-dendrogram för att klustra det euklidiska avståndet mellan prover. Vi använde limma (52) på standardiserad metabolitöverflödighet för att identifiera differentiellt rikliga metaboliter över hela celltypen och mikromiljön. För att förenkla förklaringen använder vi gruppmedelvärdesparametern för att specificera modellen och betraktar celltyperna i mikromiljön som varje grupp (n = 6 grupper); För signifikanstestet utförde vi tre upprepade mätningar för varje metabolit. För att undvika falsk replikation inkluderades patienten som ett hinder i limmadesignen. För att kontrollera skillnaderna i metaboliter mellan olika patienter justerade vi limmamodellen så att den inkluderade patienterna på ett fast sätt. Vi rapporterar signifikansen av den förspecificerade kontrasten mellan celltypen och mikromiljön för Padj <0,05 (Benjamini-Hochberg-korrektion).
Efter vigorberikning med Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80 % viabilitet) utfördes transkriptomsekvensering av encelliga celler på de totala levande frysta ascites- och tumörproverna med hjälp av ett 10x 5'-genuttrycksprotokoll. Fem fall med matchande tumörer och ascites analyserades, även om den låga viabiliteten från ett tumörprov förhindrade dess inkludering. För att uppnå flera patientselektioner kombinerade vi proverna från varje patient i banorna i 10x kromkontrollern och analyserade ascites- och tumörställena separat. Efter sekvensering [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE), Quebec genome; ett genomsnitt på 73 488 respektive 41 378 avläsningar per cell för tumör respektive ascites]], använde vi CellSNP och Vireo (53) (baserat på CellSNP som Den gemensamma humana SNP (VCF) som tillhandahålls av GRCh38 tilldelas en givaridentitet. Vi använder SNPRelate för att härleda den närmaste identiteten (IBS) för patientens genotypstatus (IBS), exklusive otilldelade celler och celler identifierade som duplex och matchande donatorer mellan ascites- och tumörprover (54). Baserat på denna uppgift behöll vi tre fall med riklig cellrepresentation i tumören och ascites för nedströmsanalys. Efter att ha utfört ett massfiltreringssteg i scater (55) och scran (56) BioConductor-paketeringen gav detta 6975 celler (2792 respektive 4183 celler från tumör respektive ascites) för analys. Vi använder igraphs (57) Louvain-klustring av delat närmaste grannnätverk (SNN) baserat på Jaccard-avstånd till klusterceller genom uttryck. Kluster annoterades manuellt till förmodade celltyper baserat på markörgenuttryck och visualiserades med t-SNE. Cytotoxiska T-celler definieras av uttrycket av CD8A och GZMA, exklusive subkluster med lågt ribosomalt proteinuttryck. Vi hämtade tillgång till publicerade data från Izar et al. (16), inklusive deras t-SNE-inbäddning, som kan kontrollera uttrycksöverlappningen mellan immuncellsmarkörer och NNMT-uttryck.
PBMC separerades från leukocytseparationsprodukter (STEMCELL Technologies) genom Ficoll-gradientdensitetscentrifugering. CD3+-celler isolerades från PBMC med hjälp av CD3-kulor (Miltenyi). I närvaro eller frånvaro av MNA aktiverades CD3+-celler med plattbunden CD3 (5 μg/ml), löslig CD28 (3 μg/ml) och IL-2 (300 U/ml; Proleukin). På den sista dagen av expansionen utvärderades viabiliteten (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) och proliferation (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) med flödescytometri. Utvärdera effektorfunktionen genom att stimulera celler med PMA (20 ng/ml) och ionomycin (1μg/ml) med GolgiStop i 4 timmar, och övervaka CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) och TNFα-fluoresceinisotiocyanat (FITC) (MAb11, BD). Stimulera qPCR- och ChIP-celler med PMA (20 ng/ml) och ionomycin (1μg/ml) i 4 timmar. ELISA-supernatanten samlades in före och efter stimulering med PMA (20 ng/ml) och ionomycin (1 μg/ml) i 4 timmar.
Följ tillverkarens protokoll för att isolera RNA med RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Använd QIAshredder (QIAGEN) för att homogenisera provet. Använd ett högkapacitets-RNA-till-cDNA-kit (Thermo Fisher Scientific) för att syntetisera komplementärt DNA (cDNA). Använd TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) för att kvantifiera genuttryck (enligt tillverkarens protokoll) med följande prober: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [glyceraldehyd-3-fosfat från väte (GAPDH)] och Hs01010726_m1 (SLC22A2). Proverna kördes på StepOnePlus realtids-PCR-system (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) i MicroAmp snabboptisk 96-brunnsreaktionsplatta (Applied Biosystems) med MicroAmp optisk film. Alla Ct-värden som överstiger 35 anses vara över detektionsgränsen och markeras som odetekterbara.
Utför ChIP enligt tidigare beskrivning (58). Kortfattat behandlades cellerna med formaldehyd (slutkoncentration 1,42 %) och inkuberades vid rumstemperatur i 10 minuter. Använd kompletterad svällbuffert (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl och 0,1 % NP-40) på is i 10 minuter, och resuspenderade sedan i immunoprecipitationsbuffert enligt beskrivning (58). Provet sonikerades sedan med följande cykler: 10 cykler (20 1-sekundspulser) och en statisk tid på 40 sekunder. Inkubera ChIP-kvalitets immunoglobulin G (Cell Signaling Technology; 1 μl), histon H3 (Cell Signaling Technology; 3 μl), NFAT (Invitrogen; 3 μl) och SP1 (Cell Signaling Technology; 3 μl) antikroppar med provet vid 4 °CC och skaka över natten. Inkubera protein A-kulor (Thermo Fisher Scientific) med provet vid 4 °C under försiktig skakning i 1 timme, använd sedan chelexkulor (Bio-Rad) för att anrika DNA:t och använd proteinas K (Thermo Fisher) för proteinnedbrytning. TNFα-promotorn detekterades med PCR: forward, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; däremot, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp produkt). Bilderna producerades av Image Lab (Bio-Rad) och kvantifierades med hjälp av ImageJ-programvaran.
Cellkultursupernatanten samlades in enligt beskrivningen ovan. Bestämningen utfördes enligt tillverkarens procedurer för humant TNFα ELISA-kit (Invitrogen), humant IL-2 ELISA-kit (Invitrogen) och humant IFN-γ ELISA-kit (Abcam). Enligt tillverkarens protokoll späddes supernatanten 1:100 för att detektera TNFα och IL-2, och 1:3 för att detektera IFN-γ. Använd EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) för att mäta absorbansen vid 450 nm.
PBMC separerades från leukocytseparationsprodukter (STEMCELL Technologies) genom Ficoll-gradientdensitetscentrifugering. CD3+-celler isolerades från PBMC med hjälp av CD3-kulor (Miltenyi). I närvaro eller frånvaro av MNA aktiverades CD3+-celler med plattbunden CD3 (5 μg/ml), löslig CD28 (3 μg/ml) och IL-2 (300 U/ml; Proleukin) i 3 dagar. Efter 3 dagar samlades cellerna in och tvättades med 0,9 % saltlösning, och pelleten frystes snabbt. Cellräkning utfördes med flödescytometri (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R-konfiguration) med användning av 123count eBeads.
Extrahera metaboliter enligt beskrivningen ovan. Det torkade extraktet rekonstituerades vid en koncentration av 4000 cellekvivalenter/μl. Analysera provet med omvänd faskromatografi (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) och CORTECS T3-kolonn (2,1×150 mm, partikelstorlek 1,6 μm, porstorlek 120 Å; #186008500, Waters). Polär masspektrometer (6470, Agilent), där elektrosprayjoniseringen arbetar i positivt läge. Mobil fas A är 0,1 % myrsyra (i H2O), mobil fas B är 90 % acetonitril, 0,1 % myrsyra. LC-gradienten är 0 till 2 minuter för 100 % A, 2 till 7,1 minuter för 99 % B och 7,1 till 8 minuter för 99 % B. Återekvilibrera sedan kolonnen med mobil fas A vid en flödeshastighet på 0,6 ml/min i 3 minuter. Flödeshastigheten är 0,4 ml/min och kolonnkammaren värms upp till 50 °C. Använd MNA:s rena kemiska standard (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Kanada) för att fastställa retentionstid (RT) och transformation (RT = 0,882 minuter, transformation 1 = 137→94,1, transformation 2 = 137→92, omvandling 3 = 137→78). När alla tre övergångar sker vid korrekt retentionstid används övergång 1 för kvantifiering för att säkerställa specificitet. Standardkurvan för MNA (Toronto Research Chemical Company) genererades genom sex serieutspädningar av stamlösningen (1 mg/ml) för att erhålla standarder på 0,1, 1,0, 10 och 100 ng/ml respektive 1,0 och 10 μg/ml vätska. Detektionsgränsen är 1 ng/ml, och det linjära svaret ligger mellan 10 ng/ml och 10 μg/ml. Varje injektion av två mikroliter prov och standard används för LC/MS-analys, och ett blandat kvalitetskontrollprov körs var åttonde injektion för att säkerställa analysplattformens stabilitet. MNA-svaren för alla MNA-behandlade cellprover låg inom analysens linjära intervall. Dataanalysen utfördes med hjälp av MassHunter kvantitativ analysprogramvara (v9.0, Agilent).
Andra generationens αFR-CAR-konstruktion hämtades från Song et al. (59). Kortfattat innehåller konstruktionen följande innehåll: CD8a-ledarsekvens, humant αFR-specifikt variabelt fragment med enkel kedja, CD8a-gångjärns- och transmembranregion, CD27 intracellulär domän och CD3z intracellulär domän. Den kompletta CAR-sekvensen syntetiserades med GenScript och klonades sedan in i andra generationens lentivirala expressionsvektor uppströms om GFP-expressionskassetten som användes för att utvärdera transduktionseffektiviteten.
Lentivirus produceras genom transfektion av HEK293T-celler [American Type Culture Collection (ATCC]; odlat i Dulbeccos modifierade Eagle-medium innehållande 10 % fetalt bovint serum (FBS) och 1 % PenStrep, och med användning av CAR-GFP-vektor och förpackningsplasmiderna (psPAX2 och pMD2.G, Addgene) använder lipofektionsamin (Sigma-Aldrich). Den virusinnehållande supernatanten samlades in 48 och 72 timmar efter transfektion, filtrerades och koncentrerades genom ultracentrifugering. Förvara den koncentrerade virussupernatanten vid -80 °C tills transduktion.
PBMC separeras från separationsprodukter för leukocyter från friska donatorer (STEMCELL Technologies) genom Ficoll-gradientdensitetscentrifugering. Använd positiv selektions-CD8-mikrokulor (Miltenyi) för att isolera CD8+-celler från PBMC. Stimulera T-celler med TransAct (Miltenyi) och i TexMACS-medium [Miltenyi; kompletterat med 3 % värmeinaktiverat humant serum, 1 % PenStrep och IL-2 (300 U/ml)]. Tjugofyra timmar efter stimulering transducerades T-celler med lentivirus (10 μl koncentrerad virussupernatant per 106 celler). 1 till 3 dagar efter transduktion på Cytek Aurora (på FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), utvärdera cellernas GFP-uttryck för att visa en transduktionseffektivitet på minst 30 %.
CAR-T-celler odlades i 24 timmar i Immunocult (STEMCELL Technologies; kompletterat med 1 % PenStrep) under följande förhållanden: obehandlade, behandlade med 250 μM adenosin eller 10 mM MNA. Efter förbehandling tvättades CAR-T-cellerna med PBS och kombinerades med 20 000 SK-OV-3-celler [ATCC; i McCoy 5A-medium (Sigma-Aldrich) kompletterat med 10 % FBS och 1 % PenStrep vid 10: Effektor-till-mål-förhållandet på 1 amplifierades i triplikat i kompletterat Immunocult-medium. SK-OV-3-celler och SK-OV-3-celler lyserade med digitalisaponin (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich) användes som negativa respektive positiva kontroller. Efter 24 timmars samodling uppsamlades supernatanten och laktatdehydrogenas (LDH) mättes enligt tillverkarens instruktioner (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). LDH-supernatanten späddes 1:50 i LDH-buffert. Avdödningsprocenten mättes med följande formel: avdödningsprocent = korrektionsprocent / maximal avdödningshastighet x 100 %, där korrektionsprocent = samodling av endast T-celler och maximal avdödningshastighet = positiv kontroll-negativ kontroll.
Som beskrivs i texten eller materialen och metoderna, använd GraphPad Prism 8, Microsoft Excel eller R v3.6.0 för statistisk analys. Om flera prover samlas in från samma patient (såsom ascites och tumör) använder vi ett parat t-test eller inkluderar patienten som en slumpmässig effekt i en linjär eller generaliserad modell, beroende på vad som är lämpligt. För metabolomikanalys utförs viktighetstestet i tre exemplar.
För kompletterande material till den här artikeln, se http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Detta är en artikel med öppen åtkomst som distribueras under villkoren i Creative Commons Attribution-Non-Commercial-licensen, som tillåter användning, distribution och reproduktion i vilket medium som helst, så länge den slutliga användningen inte är för kommersiell vinning och förutsättningen är att originalverket är korrekt. Referens.
Obs: Vi ber dig bara att ange din e-postadress så att personen du rekommenderar till sidan vet att du vill att de ska se e-postmeddelandet och att det inte är skräppost. Vi kommer inte att samla in några e-postadresser.
Den här frågan används för att testa om du är en besökare och förhindra automatisk spam.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph. G. Jones), (Ralph G. Jones), Russell G. DeB. Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA bidrar till immunsuppressionen av T-celler och representerar ett potentiellt immunterapimål för behandling av cancer hos människor.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph. G. Jones), (Ralph G. Jones), Russell G. DeB. Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA bidrar till immunsuppressionen av T-celler och representerar ett potentiellt immunterapimål för behandling av cancer hos människor.
©2021 American Association for the Advancement of Science. alla rättigheter reserverade. AAAS är partner till HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef och COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.