Propionsyra (PPA), ett svampdödande medel och vanligt förekommande kosttillsats, har visat sig orsaka onormal neurologisk utveckling hos möss tillsammans med gastrointestinal dysfunktion, vilket kan orsakas av tarmdysbios. Ett samband mellan PPA-exponering via kosten och dysbios i tarmfloran har föreslagits, men har inte undersökts direkt. Här undersökte vi PPA-associerade förändringar i tarmflorans sammansättning som kan leda till dysbios. Tarmmikrobiom hos möss som utfodrades med en obehandlad kost (n=9) och en PPA-berikad kost (n=13) sekvenserades med hjälp av långsiktig metagenomisk sekvensering för att bedöma skillnader i mikrobiell sammansättning och bakteriella metaboliska vägar. PPA-exponerad via kosten var associerad med en ökning av förekomsten av betydande taxa, inklusive flera Bacteroides-, Prevotella- och Ruminococcus-arter, av vilka medlemmar tidigare har implicerats i PPA-produktion. Mikrobiomen hos PPA-exponerade möss hade också fler vägar relaterade till lipidmetabolism och steroidhormonbiosyntes. Våra resultat indikerar att PPA kan förändra tarmfloran och dess associerade metaboliska vägar. Dessa observerade förändringar belyser att konserveringsmedel som klassificeras som säkra för konsumtion kan påverka tarmflorans sammansättning och i sin tur människors hälsa.
Det mänskliga mikrobiomet kallas ofta för "kroppens sista organ" och spelar en viktig roll för människors hälsa (Baquero och Nombela, 2012). I synnerhet är tarmmikrobiomet känt för sitt systemomfattande inflytande och roll i många viktiga funktioner. Kommensala bakterier finns i överflöd i tarmen, upptar flera ekologiska nischer, utnyttjar näringsämnen och konkurrerar med potentiella patogener (Jandhyala et al., 2015). Olika bakteriekomponenter i tarmmikrobiotan kan producera viktiga näringsämnen såsom vitaminer och främja matsmältningen (Rowland et al., 2018). Bakteriella metaboliter har också visat sig påverka vävnadsutveckling och förbättra metaboliska och immunologiska vägar (Heijtz et al., 2011; Yu et al., 2022). Sammansättningen av det mänskliga tarmmikrobiomet är extremt varierande och beror på genetiska och miljömässiga faktorer som kost, kön, mediciner och hälsostatus (Kumbhare et al., 2019).
Moderns kost är en kritisk komponent i foster- och nyföddas utveckling och en förmodad källa till föreningar som kan påverka utvecklingen (Bazer et al., 2004; Innis, 2014). En sådan förening av intresse är propionsyra (PPA), en biprodukt av kortkedjig fettsyra som erhålls från bakteriell fermentering och ett livsmedelstillsats (den Besten et al., 2013). PPA har antibakteriella och svampdödande egenskaper och används därför som livsmedelskonserveringsmedel och i industriella tillämpningar för att hämma mögel- och bakterietillväxt (Wemmenhove et al., 2016). PPA har olika effekter i olika vävnader. I levern har PPA antiinflammatoriska effekter genom att påverka cytokinuttryck i makrofager (Kawasoe et al., 2022). Denna reglerande effekt har också observerats i andra immunceller, vilket leder till nedreglering av inflammation (Haase et al., 2021). Emellertid har motsatt effekt observerats i hjärnan. Tidigare studier har visat att PPA-exponering inducerar autismliknande beteende hos möss (El-Ansary et al., 2012). Andra studier har visat att PPA kan inducera glios och aktivera proinflammatoriska vägar i hjärnan (Abdelli et al., 2019). Eftersom PPA är en svag syra kan den diffundera genom tarmepitelet in i blodomloppet och därmed korsa restriktiva barriärer inklusive blod-hjärnbarriären samt placentan (Stinson et al., 2019), vilket belyser vikten av PPA som en reglerande metabolit som produceras av bakterier. Även om PPA:s potentiella roll som en riskfaktor för autism för närvarande undersöks, kan dess effekter på individer med autism sträcka sig bortom att inducera neural differentiering.
Gastrointestinala symtom som diarré och förstoppning är vanliga hos patienter med neurologiska utvecklingsstörningar (Cao et al., 2021). Tidigare studier har visat att mikrobiomet hos patienter med autismspektrumstörningar (ASD) skiljer sig från det hos friska individer, vilket tyder på förekomst av dysbios i tarmfloran (Finegold et al., 2010). På liknande sätt skiljer sig mikrobiomets egenskaper hos patienter med inflammatoriska tarmsjukdomar, fetma, Alzheimers sjukdom etc. också från de hos friska individer (Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019). Emellertid har inget orsakssamband hittills fastställts mellan tarmmikrobiomet och neurologiska sjukdomar eller symtom (Yap et al., 2021), även om flera bakteriearter tros spela en roll i några av dessa sjukdomstillstånd. Till exempel är Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio och andra släkten mer förekommande i mikrobiotan hos patienter med autism (Tomova et al., 2015; Golubeva et al., 2017; Cristiano et al., 2018; Zurita et al., 2020). Det är värt att notera att medlemsarter i vissa av dessa släkten är kända för att ha gener associerade med PPA-produktion (Reichardt et al., 2014; Yun och Lee, 2016; Zhang et al., 2019; Baur och Dürre, 2023). Med tanke på PPA:s antimikrobiella egenskaper kan en ökning av dess förekomst vara fördelaktigt för tillväxten av PPA-producerande bakterier (Jacobson et al., 2018). Således kan en PFA-rik miljö leda till förändringar i tarmmikrobiotan, inklusive gastrointestinala patogener, vilket kan vara potentiella faktorer som leder till gastrointestinala symtom.
En central fråga inom mikrobiomforskning är huruvida skillnader i mikrobiell sammansättning är en orsak till eller ett symptom på underliggande sjukdomar. Det första steget mot att belysa det komplexa sambandet mellan kost, tarmmikrobiomet och neurologiska sjukdomar är att bedöma kostens effekter på mikrobiell sammansättning. För detta ändamål använde vi long-read metagenomisk sekvensering för att jämföra tarmmikrobiom hos avkommor till möss som utfodrades med en PPA-rik eller PPA-utarmad kost. Avkomman utfodrades med samma kost som sina mödrar. Vi antog att en PPA-rik kost skulle resultera i förändringar i tarmens mikrobiella sammansättning och mikrobiella funktionella vägar, särskilt de som är relaterade till PPA-metabolism och/eller PPA-produktion.
Denna studie använde FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J transgena möss (Jackson Laboratories) som överuttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) under kontroll av den gliaspecifika GFAP-promotorn enligt riktlinjerna från University of Central Florida Institutional Animal Care and Use Committee (UCF-IACUC) (Animal Use Permit Number: PROTO202000002). Efter avvänjning hölls mössen individuellt i burar med 1–5 möss av varje kön per bur. Mössen utfodrades ad libitum med antingen en renad kontrolldiet (modifierad öppen standarddiet, 16 kcal % fett) eller en natriumpropionat-tillsatt diet (modifierad öppen standarddiet, 16 kcal % fett, innehållande 5 000 ppm natriumpropionat). Mängden natriumpropionat som användes motsvarade 5 000 mg PFA/kg total födovikt. Detta är den högsta koncentrationen av PPA som är godkänd för användning som livsmedelskonserveringsmedel. För att förbereda sig för denna studie utfodrades föräldramössen med båda dieterna i 4 veckor före parning och fortsatte under hela mödrarnas dräktighet. Avkommorna [22 möss, 9 kontroller (6 hanar, 3 honor) och 13 PPA (4 hanar, 9 honor)] avvandes och fortsatte sedan på samma diet som mödrarna i 5 månader. Avkommorna avlivades vid 5 månaders ålder och deras tarmavföringsinnehåll samlades in och förvarades initialt i 1,5 ml mikrocentrifugrör vid -20 °C och överfördes sedan till en -80 °C frys tills värd-DNA var utarmat och mikrobiella nukleinsyror extraherades.
Värd-DNA avlägsnades enligt ett modifierat protokoll (Charalampous et al., 2019). Kortfattat överfördes fekalt innehåll till 500 µl InhibitEX (Qiagen, Cat#/ID: 19593) och förvarades fryst. Bearbeta maximalt 1–2 fekalpellets per extraktion. Fekalt innehåll homogeniserades sedan mekaniskt med en plaststöt inuti röret för att bilda en uppslamning. Centrifugera proverna vid 10 000 RCF i 5 minuter eller tills proverna har pelleterats, aspirera sedan supernatanten och resuspendera pelleten i 250 µl 1× PBS. Tillsätt 250 µl 4,4 % saponinlösning (TCI, produktnummer S0019) till provet som ett rengöringsmedel för att lossa eukaryota cellmembran. Proverna blandades försiktigt tills de var släta och inkuberades vid rumstemperatur i 10 minuter. För att bryta ner eukaryota celler tillsattes sedan 350 μl nukleasfritt vatten till provet, inkuberades i 30 sekunder och sedan tillsattes 12 μl 5 M NaCl. Proverna centrifugerades sedan vid 6000 RCF i 5 minuter. Aspirera supernatanten och resuspendera pelleten i 100 μl 1X PBS. För att avlägsna värd-DNA, tillsätt 100 μl HL-SAN-buffert (12,8568 g NaCl, 4 ml 1M MgCl2, 36 ml nukleasfritt vatten) och 10 μl HL-SAN-enzym (ArticZymes P/N 70910-202). Proverna blandades noggrant genom pipettering och inkuberades vid 37 °C i 30 minuter vid 800 rpm på en Eppendorf™ ThermoMixer C. Efter inkubation centrifugerades de vid 6000 RCF i 3 minuter och tvättades två gånger med 800 µl och 1000 µl 1X PBS. Slutligen, resuspendera pelleten i 100 µl 1X PBS.
Totalt bakteriellt DNA isolerades med New England Biolabs Monarch Genomic DNA Purification Kit (New England Biolabs, Ipswich, MA, kat.nr. T3010L). Standardförfarandet som medföljer kitet är något modifierat. Inkubera och håll nukleasfritt vatten vid 60 °C före drift för slutlig eluering. Tillsätt 10 µl proteinas K och 3 µl RNase A till varje prov. Tillsätt sedan 100 µl celllysbuffert och blanda försiktigt. Proverna inkuberades sedan i en Eppendorf™ ThermoMixer C vid 56 °C och 1400 rpm i minst 1 timme och upp till 3 timmar. Inkuberade prover centrifugerades vid 12 000 RCF i 3 minuter och supernatanten från varje prov överfördes till ett separat 1,5 ml mikrocentrifugrör innehållande 400 µl bindningslösning. Rören pulsvirvlades sedan i 5–10 sekunder med 1 sekunds intervall. Överför hela vätskeinnehållet i varje prov (cirka 600–700 µL) till en filterpatron placerad i ett genomflödesrör. Rören centrifugerades vid 1 000 RCF i 3 minuter för att möjliggöra initial DNA-bindning och centrifugerades sedan vid 12 000 RCF i 1 minut för att avlägsna kvarvarande vätska. Provkolonnen överfördes till ett nytt uppsamlingsrör och tvättades sedan två gånger. För den första tvätten, tillsätt 500 µL tvättbuffert till varje rör. Vänd röret upp och ner 3–5 gånger och centrifugera sedan vid 12 000 RCF i 1 minut. Häll vätskan från uppsamlingsröret och placera tillbaka filterpatronen i samma uppsamlingsrör. För den andra tvätten, tillsätt 500 µL tvättbuffert till filtret utan att vända det upp och ner. Proverna centrifugerades vid 12 000 RCF i 1 minut. Överför filtret till ett 1,5 ml LoBind®-rör och tillsätt 100 µL förvärmt nukleasfritt vatten. Filter inkuberades vid rumstemperatur i 1 minut och centrifugerades sedan vid 12 000 RCF i 1 minut. Eluerat DNA förvarades vid -80 °C.
DNA-koncentrationen kvantifierades med en Qubit™ 4.0 fluorometer. DNA framställdes med Qubit™ 1X dsDNA High Sensitivity Kit (katalognr. Q33231) enligt tillverkarens instruktioner. DNA-fragmentlängdsfördelningen mättes med en Aglient™ 4150 eller 4200 TapeStation. DNA framställdes med Agilent™ Genomic DNA Reagents (katalognr. 5067-5366) och Genomic DNA ScreenTape (katalognr. 5067-5365). Biblioteksförberedelse utfördes med Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) Rapid PCR Barcoding Kit (SQK-RPB004) enligt tillverkarens instruktioner. DNA sekvenserades med en ONT GridION™ Mk1-sekvenserare med en Min106D-flödescell (R 9.4.1). Sekvenseringsinställningarna var: hög noggrann basbestämning, minsta q-värde på 9, streckkodsinställning och streckkodsjustering. Proverna sekvenserades i 72 timmar, varefter basdata skickades in för vidare bearbetning och analys.
Bioinformatisk bearbetning utfördes med tidigare beskrivna metoder (Greenman et al., 2024). FASTQ-filerna som erhölls från sekvensering delades in i kataloger för varje prov. Före bioinformatisk analys bearbetades data med följande pipeline: först slogs FASTQ-filerna från proverna samman till en enda FASTQ-fil. Därefter filtrerades avläsningar kortare än 1000 bp med Filtlong v. 0.2.1, där den enda ändrade parametern var –min_length 1000 (Wick, 2024). Före ytterligare filtrering kontrollerades avläsningskvaliteten med NanoPlot v. 1.41.3 med följande parametrar: –fastq –plots dot –N50 -o(De Coster och Rademakers, 2023). Avläsningarna justerades mot musreferensgenomet GRCm39 (GCF_000001635.27) med hjälp av minimap2 v. 2.24-r1122 för att ta bort värdkontaminerade avläsningar med följande parametrar: -L -ax map-ont(Lee, 2018). De genererade alignmentfilerna konverterades till BAM-format med hjälp av samtools view -b (Danecek et al., 2021) i samtools v. 1.16.1. Icke-alignerade avläsningar identifierades sedan med hjälp av samtools view -b -f 4, vilket indikerar att dessa avläsningar inte tillhörde värdgenomet. Icke-alignerade avläsningar konverterades tillbaka till FASTQ-format med hjälp av samtools bam2fq med standardparametrar. NanoPlot kördes igen på de ytterligare filtrerade avläsningarna med de inställningar som beskrivits tidigare. Efter filtrering sammanställdes metagenomiska data med hjälp av metaflye v. 2.8.2-b1689 med följande parametrar: –nano-raw–meta (Kolmogorov et al., 2020). Lämna de återstående parametrarna på deras standardvärden. Efter montering mappades filtrerade avläsningar till monteringen med hjälp av minimap2, och parametern -ax map-ont användes för att generera en justeringsfil i SAM-format. Monteringen förfinades först med hjälp av racon v. 1.4.20 med följande parametrar: -m 8 -x -6 -g -8 -w 500 -u (Vaser et al., 2017). Efter att racon var klart förfinades den ytterligare med medaka v. 1.7.2, med hjälp av medaka_consesus, med alla parametrar utom parametern -m lämnade på sina standardvärden. Parametern -m är inställd på r941_min_hac_g507 för att specificera flödescellskemin och det högnoggrannhetsbasanrop som används för våra data (nanoporetech/medaka, 2024). De filtrerade data (nedan kallade mikrobiella data) och den slutligen rengjorda monteringen användes för efterföljande analys.
För taxonomisk klassificering klassificerades läsningar och sammansatta contigs med hjälp av Kraken2 v. 2.1.2 (Wood et al., 2019). Generera rapporter och utdatafiler för läsningar respektive sammansättningar. Använd alternativet –use-names för att analysera läsningar och sammansättningar. Alternativen –gzip-compressed och –paired anges för lässegment. Relativ förekomst av taxa i metagenom uppskattades med hjälp av Bracken v. 2.8 (Lu et al., 2017). Vi skapade först en kmer-databas innehållande 1000 baser med hjälp av bracken-build med följande parametrar: -d-k 35 -l 1000 När den är byggd körs bracken baserat på rapporten som genereras av kraken2 och filtrerar data med följande alternativ: -d -I -O-p 1000 -l

Bland dessa väljs P, G eller S beroende på vilken klassificeringsnivå som analyseras. För att minimera effekten av falskt positiva klassificeringar antogs en minimal relativ abundansgräns på 1e-4 (1/10 000 avläsningar). Före statistisk analys transformerades de relativa abundanser som rapporterades av Bracken (fraction_total_reads) med hjälp av centrerad log-ratio (CLR) transformation (Aitchison, 1982). CLR-metoden valdes för datatransformation eftersom den är skalinvariant och tillräcklig för icke-glesa datamängder (Gloor et al., 2017). CLR-transformationen använder den naturliga logaritmen. Räknedata som rapporterades av Bracken normaliserades med hjälp av det relativa logaritmiska uttrycket (RLE) (Anders och Huber, 2010). Figurer genererades med hjälp av en kombination av matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 och sekventiella logaritmer (Gloor et al., 2017). 0.12.2 och stantanotations v. 0.5.0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier et al., 2022). Bacillus/Bacteroidetes-förhållandet beräknades för varje prov med hjälp av normaliserade bakterieantal. Värden som rapporteras i tabellerna är avrundade till fyra decimaler. Simpsons diversitetsindex beräknades med hjälp av skriptet alpha_diversity.py som tillhandahålls i KrakenTools v. 1.2-paketet (Lu et al., 2022). Bracken-rapporten tillhandahålls i skriptet och Simpsons index "Si" tillhandahålls för -an-parametern. Signifikanta skillnader i förekomst definierades som genomsnittliga CLR-skillnader ≥ 1 eller ≤ -1. En genomsnittlig CLR-skillnad på ±1 indikerar en 2,7-faldig ökning av förekomsten av en provtyp. Tecknet (+/-) indikerar om taxonet är mer rikligt förekommande i PPA-provet respektive kontrollprovet. Signifikansen fastställdes med hjälp av Mann-Whitney U-testet (Virtanen et al., 2020). Statsmodels v. 0.14 (Benjamini och Hochberg, 1995; Seabold och Perktold, 2010) användes, och Benjamini-Hochberg-proceduren tillämpades för att korrigera för multipel testning. Ett justerat p-värde ≤ 0,05 användes som tröskelvärde för att fastställa statistisk signifikans.
Genannotering och relativ abundansuppskattning utfördes med hjälp av en modifierad version av protokollet som beskrivs av Maranga et al. (Maranga et al., 2023). Först avlägsnades contigs kortare än 500 bp från alla assembler med hjälp av SeqKit v. 2.5.1 (Shen et al., 2016). De utvalda assemblerna kombinerades sedan till ett pan-metagenom. Öppna läsramar (ORF) identifierades med hjälp av Prodigal v. 1.0.1 (en parallell version av Prodigal v. 2.6.3) med följande parametrar: -d-f gff-i -O-T 24 -p meta -C 10000 (Hyett et al., 2012; Jaenicke, 2024). De resulterande nukleotidfilerna filtrerades sedan med Python för att ta bort alla ofullständiga gener. CD-HIT v. 4.8.1 användes sedan för att klustra generna med följande parametrar: cd-hit-est -i -O-c 0,95 -s 0,85 -aS 0,9 -n 10 -d 256 -M 350000 -T 24 -l 100 -g 1 (Fu et al., 2012). Den genererade icke-redundanta genkatalogen användes för att uppskatta genförekomst och annotering. Relativ genförekomst uppskattades med KMA v. 1.4.9 (Clausen et al., 2018). Skapa först en indexfil med KMA-index med följande parametrar: -i -OSedan, med hjälp av indexet som genererats tillsammans med de mikrobiella avläsningarna för varje prov enligt beskrivningen i avsnittet Bioinformatikpipeline, kördes KMA med följande parametrar: -i -O-t_db-bcNano -bc 0.7 -ef -t 24. Därefter normaliserades genräkningarna med hjälp av CLR, och principal component analysis (PCA)-klassen från Sci-kit learn användes (Pedregosa et al., 2011). Den förutspådda genannoteringen utfördes på den icke-redundanta genkatalogen med hjälp av emapper.py-skriptet från eggNOG v. 2.1.12 och eggNOG-databasen version 5.0.2 med följande parametrar: –itype CDS –cpu 24 -i– Datakatalog–go_evidence Icke-elektronisk – utdata– Utdatakatalog–target_orthologs all –seed_ortholog_evalue 0.001 –seed_ortholog_score 60 –query_cover 20 –subject_cover 0 –translate –override –temp_dir(Cantalapiedra et al., 2021). KMA-resultaten screenades för att välja gener med tillräcklig malltäckning och mallidentitet (≥ 90%) och förekomst (djup ≥ 3). KMA-djupresultaten transformerades med hjälp av CLR enligt beskrivningen ovan. KMA-resultaten jämfördes sedan med contig-ID:n från de funktionella annoterings- och klassificeringsresultaten med hjälp av contig-källan för varje gen. Liksom med taxa definierades signifikanta skillnader i genförekomst som gener med en genomsnittlig CLR-skillnad ≥ 1 eller ≤ -1, med ett tecken (+/-) som indikerar att genen var mer riklig i PPA- respektive kontrollproverna.
Gener grupperades först enligt Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) ortolog (KO) identifierare tilldelade av eggNOG för att jämföra genvägsförekomster. Gener utan knockouts eller gener med flera knockouts togs bort före analys. Den genomsnittliga förekomsten av varje KO per prov beräknades sedan och statistisk analys utfördes. PPA-metabolismgener definierades som vilken gen som helst som tilldelades en rad ko00640 i KEGG_Pathway-kolumnen, vilket indikerar en roll i propionatmetabolism enligt KEGG. Gener identifierade som associerade med PPA-produktion listas i kompletterande tabell 1 (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017). Permutationstester utfördes för att identifiera PPA-metabolism- och produktionsgener som var signifikant mer förekommande i varje provtyp. Ett tusen permutationer utfördes för varje analyserad gen. Ett p-värde på 0,05 användes som ett gränsvärde för att bestämma statistisk signifikans. Funktionella annoteringar tilldelades individuella gener inom ett kluster baserat på annoteringarna av representativa gener inom klustret. Taxa associerade med PPA-metabolism och/eller PPA-produktion kunde identifieras genom att matcha contig-ID:n i Kraken2-utdatafilerna med samma contig-ID:n som behölls under funktionell annotering med eggNOG. Signifikanstestning utfördes med hjälp av Mann-Whitney U-testet som beskrivits tidigare. Korrigering för multipel testning utfördes med Benjamini-Hochberg-proceduren. Ett p-värde på ≤ 0,05 användes som gränsvärde för att bestämma statistisk signifikans.
Mångfalden i tarmmikrobiomet hos möss bedömdes med hjälp av Simpsons mångfaldsindex. Inga signifikanta skillnader observerades mellan kontroll- och PPA-proverna vad gäller släkte- och artsmångfald (p-värde för släkte: 0,18, p-värde för art: 0,16) (Figur 1). Den mikrobiella sammansättningen jämfördes sedan med hjälp av principal component analysis (PCA). Figur 2 visar klustringen av prover efter deras fyla, vilket indikerar att det fanns skillnader i mikrobiomens artsammansättning mellan PPA- och kontrollproverna. Denna klustring var mindre uttalad på släktenivå, vilket tyder på att PPA påverkar vissa bakterier (Kompletterande Fig. 1).
Figur 1. Alfadiversitet hos släkten och artsammansättning i musens tarmmikrobiom. Boxdiagram som visar Simpsons diversitetsindex för släkten (A) och arter (B) i PPA- och kontrollprover. Signifikansen bestämdes med Mann-Whitney U-testet och multipel korrigering utfördes med Benjamini-Hochberg-proceduren. ns, p-värdet var inte signifikant (p>0,05).
Figur 2. Resultat av principalkomponentanalys av musens tarmmikrobiomsammansättning på artnivå. Principalkomponentanalysdiagrammet visar fördelningen av prover över deras två första principalkomponenter. Färger indikerar provtyp: PPA-exponerade möss är lila och kontrollmöss är gula. Principalkomponenterna 1 och 2 är ritade på x- respektive y-axeln och uttrycks som deras förklarade variansförhållande.
Med hjälp av RLE-transformerade räkningsdata observerades en signifikant minskning av medianförhållandet Bacteroidetes/Bacilli hos kontroll- och PPA-möss (kontroll: 9,66, PPA: 3,02; p-värde = 0,0011). Denna skillnad berodde på en högre förekomst av Bacteroidetes hos PPA-möss jämfört med kontrollmöss, även om skillnaden inte var signifikant (genomsnittlig CLR för kontroll: 5,51, genomsnittlig CLR för PPA: 6,62; p-värde = 0,054), medan förekomsten av Bacteroidetes var likartad (genomsnittlig CLR för kontroll: 7,76, genomsnittlig CLR för PPA: 7,60; p-värde = 0,18).
Analys av förekomsten av taxonomiska medlemmar i tarmmikrobiomet visade att 1 fylum och 77 arter skilde sig signifikant mellan PPA- och kontrollprover (kompletterande tabell 2). Förekomsten av 59 arter i PPA-prover var signifikant högre än i kontrollprover, medan förekomsten av endast 16 arter i kontrollprover var högre än i PPA-prover (figur 3).
Figur 3. Differentiell förekomst av taxa i tarmmikrobiomet hos PPA- och kontrollmöss. Vulkandiagram visar skillnader i förekomsten av släkten (A) eller arter (B) mellan PPA- och kontrollprover. Grå prickar indikerar ingen signifikant skillnad i taxaförekomst. Färgade prickar indikerar signifikanta skillnader i förekomst (p-värde ≤ 0,05). De 20 största taxona med de största skillnaderna i förekomst mellan provtyperna visas i rött respektive ljusblått (kontroll- och PPA-prover). Gula och lila prickar var minst 2,7 gånger mer förekommande i kontroll- eller PPA-prover än i kontroller. Svarta prickar representerar taxa med signifikant olika förekomster, med genomsnittliga CLR-skillnader mellan -1 och 1. P-värden beräknades med hjälp av Mann-Whitney U-testet och korrigerades för multipel testning med hjälp av Benjamini-Hochberg-proceduren. Fetstilta genomsnittliga CLR-skillnader indikerar signifikanta skillnader i förekomst.
Efter att ha analyserat tarmmikrobiella sammansättningar utförde vi en funktionell annotering av mikrobiomet. Efter att ha filtrerat bort gener av låg kvalitet identifierades totalt 378 355 unika gener i alla prover. Den transformerade förekomsten av dessa gener användes för principal component analysis (PCA), och resultaten visade en hög grad av klusterbildning av provtyper baserat på deras funktionella profiler (Figur 4).
Figur 4. PCA-resultat med hjälp av den funktionella profilen för musens tarmmikrobiom. PCA-diagrammet visar fördelningen av prover över deras två första huvudkomponenter. Färger indikerar provtyp: PPA-exponerade möss är lila och kontrollmöss är gula. Huvudkomponenterna 1 och 2 är ritade på x- respektive y-axeln och uttrycks som deras förklarade variansförhållande.
Vi undersökte sedan förekomsten av KEGG-knockouts i olika provtyper. Totalt 3648 unika knockouts identifierades, varav 196 var signifikant mer förekommande i kontrollprover och 106 var mer förekommande i PPA-prover (Figur 5). Totalt 145 gener detekterades i kontrollprover och 61 gener i PPA-prover, med signifikant olika förekomster. Signalvägar relaterade till lipid- och aminosockermetabolism var signifikant mer berikade i PPA-prover (kompletterande tabell 3). Signalvägar relaterade till kvävemetabolism och svavelreläsystem var signifikant mer berikade i kontrollprover (kompletterande tabell 3). Förekomsten av gener relaterade till aminosocker-/nukleotidmetabolism (ko:K21279) och inositolfosfatmetabolism (ko:K07291) var signifikant högre i PPA-prover (Figur 5). Kontrollprover hade signifikant fler gener relaterade till bensoatmetabolism (ko:K22270), kvävemetabolism (ko:K00368) och glykolys/glukoneogenes (ko:K00131) (Figur 5).
Fig. 5. Differentiell förekomst av KO i tarmmikrobiomet hos PPA- och kontrollmöss. Vulkandiagrammet visar skillnaderna i förekomsten av funktionella grupper (KO). Grå prickar indikerar KO vars förekomst inte skilde sig signifikant mellan provtyperna (p-värde > 0,05). Färgade prickar indikerar signifikanta skillnader i förekomst (p-värde ≤ 0,05). De 20 KO med de största skillnaderna i förekomst mellan provtyperna visas i rött och ljusblått, motsvarande kontroll- respektive PPA-prover. Gula och lila prickar indikerar KO som var minst 2,7 gånger mer förekommande i kontroll- respektive PPA-prover. Svarta prickar indikerar KO med signifikant olika förekomster, med genomsnittliga CLR-skillnader mellan -1 och 1. P-värden beräknades med Mann-Whitney U-testet och justerades för multipla jämförelser med Benjamini-Hochberg-proceduren. NaN indikerar att KO inte tillhör en signalväg i KEGG. Fetstilta genomsnittliga CLR-skillnadsvärden indikerar signifikanta skillnader i förekomst. För detaljerad information om de vägar som de listade KO:erna tillhör, se kompletterande tabell 3.
Bland de annoterade generna hade 1601 gener signifikant olika förekomster mellan provtyperna (p ≤ 0,05), där varje gen var minst 2,7 gånger mer riklig. Av dessa gener var 4 gener mer rikliga i kontrollprover och 1597 gener var mer rikliga i PPA-prover. Eftersom PPA har antimikrobiella egenskaper undersökte vi förekomsten av PPA-metabolism- och produktionsgener mellan provtyperna. Bland de 1332 PPA-metabolismrelaterade generna var 27 gener signifikant mer rikliga i kontrollprover och 12 gener var mer rikliga i PPA-prover. Bland de 223 PPA-produktionsrelaterade generna var 1 gen signifikant mer riklig i PPA-prover. Figur 6A visar vidare den högre förekomsten av gener involverade i PPA-metabolism, med signifikant högre förekomst i kontrollprover och stora effektstorlekar, medan figur 6B belyser enskilda gener med signifikant högre förekomst observerad i PPA-prover.
Fig. 6. Differentiell förekomst av PPA-relaterade gener i musens tarmmikrobiom. Vulkandiagram visar skillnaderna i förekomsten av gener associerade med PPA-metabolism (A) och PPA-produktion (B). Grå prickar indikerar gener vars förekomst inte skilde sig signifikant mellan provtyper (p-värde > 0,05). Färgade prickar indikerar signifikanta skillnader i förekomst (p-värde ≤ 0,05). De 20 generna med de största skillnaderna i förekomst visas i rött respektive ljusblått (kontroll- och PPA-prover). Förekomsten av gula och lila prickar var minst 2,7 gånger större i kontroll- och PPA-prover än i kontrollprover. Svarta prickar representerar gener med signifikant olika förekomster, med genomsnittliga CLR-skillnader mellan -1 och 1. P-värden beräknades med hjälp av Mann-Whitney U-testet och korrigerades för multipla jämförelser med hjälp av Benjamini-Hochberg-proceduren. Gener motsvarar representativa gener i den icke-redundanta genkatalogen. Gennamn består av KEGG-symbolen som betecknar en KO-gen. Fetstilta genomsnittliga CLR-skillnader indikerar signifikant olika förekomster. Ett streck (-) indikerar att det inte finns någon symbol för genen i KEGG-databasen.
Taxa med gener relaterade till PPA-metabolism och/eller -produktion identifierades genom att matcha contigernas taxonomiska identitet med genens contig-ID. På släktenivå fann man att 130 släkten hade gener relaterade till PPA-metabolism och 61 släkten hade gener relaterade till PPA-produktion (kompletterande tabell 4). Emellertid uppvisade inga släkten signifikanta skillnader i förekomst (p > 0,05).
På artnivå fann man att 144 bakteriearter hade gener associerade med PPA-metabolism och 68 bakteriearter hade gener associerade med PPA-produktion (kompletterande tabell 5). Bland PPA-metabolisatorerna uppvisade åtta bakterier signifikanta ökningar i förekomst mellan provtyper, och alla uppvisade signifikanta förändringar i effekt (kompletterande tabell 6). Alla identifierade PPA-metabolisatorer med signifikanta skillnader i förekomst var mer förekommande i PPA-prover. Klassificering på artnivå avslöjade representanter för släkten som inte skilde sig signifikant mellan provtyper, inklusive flera Bacteroides- och Ruminococcus-arter, samt Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus och Alcaligenes polymorpha. Bland de PPA-producerande bakterierna uppvisade fyra bakterier signifikanta skillnader i förekomst mellan provtyper. Arter med signifikanta skillnader i förekomst inkluderade Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis och Ruminococcus bovis.
I denna studie undersökte vi effekterna av PPA-exponering på mössens tarmflora. PPA kan framkalla olika reaktioner hos bakterier eftersom det produceras av vissa arter, används som födokälla av andra arter eller har antimikrobiella effekter. Därför kan dess tillsats till tarmmiljön via kosttillskott ha olika effekter beroende på tolerans, känslighet och förmågan att använda det som näringskälla. Känsliga bakteriearter kan elimineras och ersättas av de som är mer resistenta mot PPA eller kan använda det som födokälla, vilket leder till förändringar i tarmflorans sammansättning. Våra resultat visade signifikanta skillnader i mikrobiell sammansättning men ingen effekt på den totala mikrobiella mångfalden. De största effekterna observerades på artsnivå, med över 70 taxa som skilde sig signifikant i mängd mellan PPA och kontrollprover (kompletterande tabell 2). Ytterligare utvärdering av sammansättningen av PPA-exponerade prover avslöjade större heterogenitet hos mikrobiella arter jämfört med oexponerade prover, vilket tyder på att PPA kan förbättra bakterietillväxtegenskaperna och begränsa bakteriepopulationer som kan överleva i PPA-rika miljöer. Således kan PPA selektivt inducera förändringar snarare än orsaka omfattande störningar av tarmflorans mångfald.
Livsmedelskonserveringsmedel som PPA har tidigare visat sig förändra förekomsten av tarmmikrobiomkomponenter utan att påverka den totala mångfalden (Nagpal et al., 2021). Här observerade vi de mest slående skillnaderna mellan Bacteroidetes-arter inom stammen Bacteroidetes (tidigare känd som Bacteroidetes), vilka var signifikant berikade hos PPA-exponerade möss. Ökad förekomst av Bacteroides-arter är förknippad med ökad slemnedbrytning, vilket kan öka risken för infektion och främja inflammation (Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019). En studie fann att nyfödda hanmöss behandlade med Bacteroides fragilis uppvisade sociala beteenden som påminner om autismspektrumstörning (ASD) (Carmel et al., 2023), och andra studier har visat att Bacteroides-arter kan förändra immunaktiviteten och leda till autoimmun inflammatorisk kardiomyopati (Gil-Cruz et al., 2019). Arter som tillhör släktena Ruminococcus, Prevotella och Parabacteroides ökade också signifikant hos möss exponerade för PPA (Coretti et al., 2018). Vissa Ruminococcus-arter är associerade med sjukdomar som Crohns sjukdom genom produktion av proinflammatoriska cytokiner (Henke et al., 2019), medan Prevotella-arter som Prevotella humani är associerade med metabola sjukdomar som hypertoni och insulinkänslighet (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017). Slutligen fann vi att förhållandet mellan Bacteroidetes (tidigare känt som Firmicutes) och Bacteroidetes var signifikant lägre hos PPA-exponerade möss än hos kontrollmöss på grund av en högre total förekomst av Bacteroidetes-arter. Detta förhållande har tidigare visat sig vara en viktig indikator på intestinal homeostas, och störningar i detta förhållande har associerats med olika sjukdomstillstånd (Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023), inklusive inflammatoriska tarmsjukdomar (Stojanov et al., 2020). Sammantaget verkar arter av stammen Bacteroidetes påverkas starkast av förhöjd PPA i kosten. Detta kan bero på en högre tolerans mot PPA eller förmågan att använda PPA som energikälla, vilket har visat sig vara sant för minst en art, Hoylesella enocea (Hitch et al., 2022). Alternativt kan exponering för moderns PPA förbättra fosterutvecklingen genom att göra tarmen hos musavkomman mer mottaglig för Bacteroidetes-kolonisering; vår studiedesign tillät dock inte en sådan bedömning.
Metagenomisk bedömning av innehållet avslöjade signifikanta skillnader i förekomsten av gener associerade med PPA-metabolism och -produktion, där PPA-exponerade möss uppvisade en högre förekomst av gener ansvariga för PPA-produktion, medan icke-PPA-exponerade möss uppvisade en högre förekomst av gener ansvariga för PAA-metabolism (Figur 6). Dessa resultat tyder på att effekten av PPA på mikrobiell sammansättning kanske inte enbart beror på dess användning, annars borde förekomsten av gener associerade med PPA-metabolism ha visat en högre förekomst i tarmmikrobiomet hos PPA-exponerade möss. En förklaring är att PPA medierar bakteriell förekomst främst genom sina antimikrobiella effekter snarare än genom dess användning av bakterier som näringsämne. Tidigare studier har visat att PPA hämmar tillväxten av Salmonella Typhimurium på ett dosberoende sätt (Jacobson et al., 2018). Exponering för högre koncentrationer av PPA kan selektera för bakterier som är resistenta mot dess antimikrobiella egenskaper och inte nödvändigtvis kan metabolisera eller producera det. Till exempel uppvisade flera Parabacteroides-arter signifikant högre förekomst i PPA-prover, men inga gener relaterade till PPA-metabolism eller -produktion detekterades (kompletterande tabeller 2, 4 och 5). Dessutom är PPA-produktion som en fermenteringsbiprodukt vitt distribuerad bland olika bakterier (Gonzalez-Garcia et al., 2017). Högre bakteriell mångfald kan vara orsaken till den högre förekomsten av gener relaterade till PPA-metabolism i kontrollprover (Averina et al., 2020). Dessutom förutspåddes endast 27 (2,14%) av 1332 gener vara gener associerade exklusivt med PPA-metabolism. Många gener associerade med PPA-metabolism är också involverade i andra metaboliska vägar. Detta visar ytterligare att förekomsten av gener involverade i PPA-metabolism var högre i kontrollproverna; dessa gener kan fungera i vägar som inte resulterar i PPA-användning eller -bildning som en biprodukt. I detta fall uppvisade endast en gen associerad med PPA-generering signifikanta skillnader i förekomst mellan provtyper. Till skillnad från gener associerade med PPA-metabolism valdes markörgener för PPA-produktion eftersom de är direkt involverade i den bakteriella vägen för PPA-produktion. Hos PPA-exponerade möss fann man att alla arter hade signifikant ökad förekomst och kapacitet att producera PPA. Detta stöder förutsägelsen att PPA:er skulle välja PPA-producenter och därför förutsäga att PPA-produktionskapaciteten skulle öka. Genförekomst korrelerar dock inte nödvändigtvis med genuttryck; även om förekomsten av gener associerade med PPA-metabolism är högre i kontrollprover, kan uttryckshastigheten vara annorlunda (Shi et al., 2014). För att bekräfta sambandet mellan prevalensen av PPA-producerande gener och PPA-produktion behövs studier av uttrycket av gener involverade i PPA-produktion.
Funktionell annotering av PPA- och kontrollmetagenomen avslöjade vissa skillnader. PCA-analys av geninnehåll avslöjade diskreta kluster mellan PPA- och kontrollprover (Figur 5). Kluster inom provet visade att kontrollgeninnehållet var mer diversifierat, medan PPA-prover klustrade tillsammans. Kluster efter geninnehåll var jämförbar med kluster efter artsammansättning. Således är skillnader i signalvägarnas förekomst förenliga med förändringar i förekomsten av specifika arter och stammar inom dem. I PPA-prover var två signalvägar med signifikant högre förekomst relaterade till aminosocker/nukleotid-sockermetabolism (ko:K21279) och flera lipidmetabolismvägar (ko:K00647, ko:K03801; Kompletterande tabell 3). Gener associerade med ko:K21279 är kända för att vara associerade med släktet Bacteroides, ett av släktena med ett signifikant högre antal arter i PPA-proverna. Detta enzym kan undvika immunsvaret genom att uttrycka kapsulära polysackarider (Wang et al., 2008). Detta kan förklara ökningen av Bacteroidetes som observerats hos PPA-exponerade möss. Detta kompletterar den ökade fettsyrasyntesen som observerats i PPA-mikrobiomet. Bakterier använder FASIIko:K00647 (fabB)-vägen för att producera fettsyror, vilket kan påverka värdens metaboliska vägar (Yao och Rock, 2015; Johnson et al., 2020), och förändringar i lipidmetabolismen kan spela en roll i neurologisk utveckling (Yu et al., 2020). En annan väg som visar ökad förekomst i PPA-prover var steroidhormonbiosyntes (ko:K12343). Det finns växande bevis för att det finns ett omvänt samband mellan tarmflorans förmåga att påverka hormonnivåer och att påverkas av hormoner, så att förhöjda steroidnivåer kan ha hälsokonsekvenser nedströms (Tetel et al., 2018).
Denna studie är inte utan begränsningar och överväganden. En viktig skillnad är att vi inte utförde fysiologiska bedömningar av djuren. Därför är det inte möjligt att direkt dra slutsatsen om förändringar i mikrobiomet är associerade med någon sjukdom. En annan faktor är att mössen i denna studie fick samma kost som sina mödrar. Framtida studier kan avgöra om en övergång från en PPA-rik kost till en PPA-fri kost förbättrar dess effekter på mikrobiomet. En begränsning i vår studie, liksom många andra, är den begränsade urvalsstorleken. Även om giltiga slutsatser kan dras, skulle en större urvalsstorlek ge större statistisk styrka vid analys av resultaten. Vi är också försiktiga med att dra slutsatser om ett samband mellan förändringar i tarmmikrobiomet och någon sjukdom (Yap et al., 2021). Störande faktorer inklusive ålder, kön och kost kan avsevärt påverka mikroorganismernas sammansättning. Dessa faktorer kan förklara de inkonsekvenser som observerats i litteraturen angående sambandet mellan tarmmikrobiomet och komplexa sjukdomar (Johnson et al., 2019; Lagod och Naser, 2023). Till exempel har medlemmar av släktet Bacteroidetes visat sig antingen vara ökade eller minskade hos djur och människor med ASD (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017). På liknande sätt har studier av tarmsammansättning hos patienter med inflammatoriska tarmsjukdomar funnit både ökningar och minskningar i samma taxa (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023). För att begränsa effekten av könsbias försökte vi säkerställa lika representation av könen så att skillnaderna troligen berodde på kosten. En utmaning med funktionell annotering är borttagningen av redundanta gensekvenser. Vår genklustringsmetod kräver 95 % sekvensidentitet och 85 % längdlikhet, samt 90 % alignment-täckning för att eliminera falsk kluster. I vissa fall observerade vi dock COG:er med samma annoteringar (t.ex. MUT) (Fig. 6). Ytterligare studier behövs för att avgöra om dessa ortologer är distinkta, associerade med specifika släkten, eller om detta är en begränsning av genklustermetoden. En annan begränsning av funktionell annotering är potentiell felklassificering; bakteriegenen mmdA är ​​ett känt enzym involverat i propionatsyntes, men KEGG associerar det inte med propionatmetabolismvägen. Däremot är scpB- och mmcD-ortologerna besläktade. Det stora antalet gener utan utsedda knockouts kan resultera i en oförmåga att identifiera PPA-relaterade gener vid bedömning av genförekomst. Framtida studier kommer att dra nytta av metatranskriptomanalys, vilket kan ge en djupare förståelse av tarmmikrobiotans funktionella egenskaper och koppla genuttryck till potentiella nedströmseffekter. För studier som involverar specifika neurologiska utvecklingsstörningar eller inflammatoriska tarmsjukdomar behövs fysiologiska och beteendemässiga bedömningar av djur för att koppla förändringar i mikrobiomets sammansättning till dessa störningar. Ytterligare studier som transplanterar tarmmikrobiomet till bakteriefria möss skulle också vara användbara för att avgöra om mikrobiomet är en drivkraft eller kännetecken för sjukdom.
Sammanfattningsvis visade vi att PPA i kosten påverkar tarmflorans sammansättning. PPA är ett FDA-godkänt konserveringsmedel som finns i stor utsträckning i olika livsmedel och som vid långvarig exponering kan leda till störningar i den normala tarmfloran. Vi fann förändringar i förekomsten av flera bakterier, vilket tyder på att PPA kan påverka tarmflorans sammansättning. Förändringar i mikrobiotan kan leda till förändringar i nivåerna av vissa metaboliska vägar, vilket kan leda till fysiologiska förändringar som är relevanta för värdens hälsa. Ytterligare studier behövs för att avgöra om effekterna av PPA i kosten på den mikrobiella sammansättningen kan leda till dysbios eller andra sjukdomar. Denna studie lägger grunden för framtida studier om hur PPA:s effekter på tarmflorans sammansättning kan påverka människors hälsa.
Dataseten som presenteras i denna studie finns tillgängliga i online-databaser. Databasnamn och accessionsnummer är: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Denna djurstudie godkändes av University of Central Florida Institutional Animal Care and Use Committee (UCF-IACUC) (tillståndsnummer för djuranvändning: PROTO202000002). Studien uppfyller lokala lagar, förordningar och institutionella krav.
NG: Konceptualisering, Datakurering, Formell analys, Undersökning, Metodologi, Programvara, Visualisering, Skrivande (ursprungligt utkast), Skrivande (granskning och redigering). LA: Konceptualisering, Datakurering, Metodologi, Resurser, Skrivande (granskning och redigering). SH: Formell analys, Programvara, Skrivande (granskning och redigering). SA: Undersökning, Skrivande (granskning och redigering). Överdomare: Undersökning, Skrivande (granskning och redigering). SN: Konceptualisering, Projektadministration, Resurser, Handledning, Skrivande (granskning och redigering). TA: Konceptualisering, Projektadministration, Handledning, Skrivande (granskning och redigering).
Författarna förklarade att de inte mottagit något ekonomiskt stöd för forskningen, författarskapet och/eller publiceringen av denna artikel.
Författarna försäkrar att forskningen genomfördes utan några kommersiella eller finansiella relationer som skulle kunna tolkas som en potentiell intressekonflikt. Ej tillämpligt.
Alla åsikter som uttrycks i denna artikel är enbart författarnas egna och återspeglar inte nödvändigtvis åsikterna hos deras institutioner, utgivare, redaktörer eller granskare. Produkter som utvärderas i denna artikel, eller påståenden från deras tillverkare, garanteras eller godkänns inte av utgivaren.
Kompletterande material till denna artikel finns online: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
Abdelli LS, Samsam A, Nasser SA (2019). Propionsyra inducerar glios och neuroinflammation genom att reglera PTEN/AKT-vägen vid autismspektrumstörningar. Scientific reports 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
Aitchison, J. (1982). Statistisk analys av sammansättningsdata. JR Stat Soc Ser B Methodol. 44, 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
Ahn J, Kwon H, Kim YJ (2023). Firmicutes/Bacteroidetes-kvoten som riskfaktor för bröstcancer. Journal of Clinical Medicine, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
Anders S., Huber W. (2010). Differentiell uttrycksanalys av sekvensräkningsdata. Nat Prev. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
Angelis, MD, Piccolo, M., Vannini, L., Siragusa, S., Giacomo, AD, Serrazanetti, DI, et al. (2013). Avföringsmikrobiota och metabolomet hos barn med autism och genomgripande utvecklingsstörning som inte specificerats på annat sätt. PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
Averina OV, Kovtun AS, Polyakova SI, Savilova AM, Rebrikov DV, Danilenko VN (2020). Bakteriella neurometaboliska egenskaper hos tarmfloran hos små barn med autismspektrumstörningar. Journal of Medical Microbiology 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
Baquero F., Nombela K. (2012). Mikrobiomet som ett mänskligt organ. Clinical Microbiology and Infection 18, 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
Baur T., Dürre P. (2023). Nya insikter i fysiologin hos propionsyraproducerande bakterier: Anaerotignum propionicum och Anaerotignum neopropionicum (tidigare Clostridium propionicum och Clostridium neopropionicum). Microorganisms 11, 685. doi: 10.3390/microorganisms11030685
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004). Moderns näring och fosterutveckling. J Nutr. 134, 2169-2172. doi: 10.1093/jn/134.9.2169
Benjamini, Y., och Hochberg, J. (1995). Kontroll av andelen falskt positiva resultat: En praktisk och effektiv metod för multipel testning. JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x