Javascript är för närvarande inaktiverat i din webbläsare. Vissa funktioner på den här webbplatsen fungerar inte när javascript är inaktiverat.
Registrera dig med dina specifika uppgifter och det specifika läkemedlet du är intresserad av så matchar vi informationen du anger med artiklar i vår omfattande databas och skickar dig en PDF-kopia via e-post.
Ban-Lan-Gen-granuler dämpar dextran-natriumsulfat-inducerad kronisk återfallande kolit hos möss genom att modulera tarmfloran och återställa tarmens SCFA-produktion.
Jiao Peng, 1-3, * Li Xi, 4, * Zheng Lin, 3, 5 Duan Lifang, 1 Gao Zhengxian, 2, 5 Diehu, 1 Li Jie, 6 Li Xiaofeng, 6 Shen Xiangchun, 5 Xiao Haitao 21 Peking University Shenzhen Hospital Farmaceutiska institutionen, Shenzhen, Folkrepubliken Kina; 2 Shenzhen University Health Science Center Farmaceutiska fakulteten, Shenzhen, Folkrepubliken Kina; 3 Guizhou Medical University Engineering Technology Research Center of Ethnic Medicine and Traditional Chinese Medicine Development and Application Ministry of Education, Guizhou Provincial Key Laboratory of Pharmacy, Guizhou Medical University, Guiyang, Folkrepubliken Kina; 4 Institutionen för gastroenterologi, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen, Folkrepubliken Kina; 5 Farmaceutiska fakulteten, Guizhou Medical University, Statliga nyckellaboratoriet för medicinalväxters funktion och tillämpning, Guiyang; 6 Institutionen för laboratoriemedicin, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen, Kina [email protected] Shen Xiangchun, Farmaceutiska fakulteten, Guizhou Medical University, Guizhou, Folkrepubliken Kina, 550004, E-post [email protected] Syfte: GLP-1-baserad terapi är ett nytt behandlingsalternativ för inflammatorisk tarmsjukdom. Ban-Lan-Gen (BLG)-granulat är en känd antiviral TCM-formulering som uppvisar potentiell antiinflammatorisk aktivitet vid behandling av olika inflammatoriska tillstånd. Dess antiinflammatoriska effekt på kolit och dess verkningsmekanism är dock fortfarande oklara. METODER: Att fastställa dextran-natriumsulfat (DSS)-inducerad kronisk recidiverande kolit hos möss. Sjukdomsaktivitetsindex, histologiska markörer för skada och proinflammatoriska cytokinnivåer utfördes för att bedöma den skyddande effekten av BLG. Effekterna av BLG på tarmfloran och tarmen karakteriserades genom serum-GLP-1-nivåer och kolon Gcg-, GPR41- och GRP43-uttryck, tarmflorans sammansättning, fekala SCFA-nivåer och GLP-1-frisättning från Produktion av GLP-1 från primära muskolonepitelceller, SCFA-deriverad. Resultat: BLG-behandling minskade signifikant kroppsviktsförlust, DAI, kolonförkortning, kolonvävnadsskada och proinflammatoriska cytokinnivåer av TNF-α, IL-1β och IL-6 i kolonvävnad. Dessutom kan BLG-behandling avsevärt återställa uttrycket av Gcg, GPR41 och GRP43 i kolon och serumnivåerna av GLP-1 hos möss med kolit, och genom att öka SCFA-producerande bakterier såsom Akkermansia och Prevotellaceae_UCG-001, och minska förekomsten av bakterier såsom Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas och Oscillibacter. Dessutom kan BLG-behandling avsevärt öka nivån av SCFA i avföringen från möss med kolit. Samtidigt visade in vitro-experiment också att fekalt extrakt från BLG-behandlade möss kraftigt kan stimulera de primära små murina kolonepitelcellerna som utsöndrar GLP-1. Slutsatser: Dessa fynd tyder på att BLG har en antikoliteffekt. BLG har potential att utvecklas som en terapi, åtminstone delvis genom att modulera tarmfloran och återställa intestinal SCFA-deriverad GLP-1-produktion. Lovande läkemedel för kronisk recidiverande kolit. Nyckelord: kolit, Ban-Lan-Gen-granuler, tarmflora, kortkedjiga fettsyror, GLP-1
Ulcerös kolit (UC) är en långvarig inflammatorisk sjukdom i tjocktarmen och ändtarmen som kännetecknas av återkommande diarré, buksmärtor, viktminskning och mukopulent blodig avföring.1 Nyligen har förekomsten av UC ökat i länder med tidigare låg incidens, inklusive Kina, med den ökande populariteten för västerländska livsstilar.2 Denna ökning innebär stora problem för folkhälsan och har allvarliga konsekvenser för patienters arbetsförmåga och livskvalitet. Det är värt att notera att patogenesen för UC fortfarande är i stort sett oklar, men det är allmänt accepterat att genetik, miljöfaktorer, tarmfloran och immunsystemet alla bidrar till utvecklingen av UC.3 Även nu finns det inget botemedel mot UC, och målet med behandlingen är att kliniskt kontrollera kliniska symtom, inducera och upprätthålla remission, främja slemhinneläkning och minska återfall. Klassiska behandlingar inkluderar aminosalicylater, kortikosteroider, immunsuppressiva medel och biologiska läkemedel. Dessa läkemedel kan dock inte uppnå önskad effekt på grund av deras olika biverkningar.4 Nyligen har många fallstudier visat att traditionell kinesisk medicin (TCM) har visat stor potential att hjälpa till. att lindra UC med låg toxicitet, vilket tyder på att utvecklingen av nya TCM-terapier är en lovande behandlingsstrategi för UC.5-7
Banlangen Granules (BLG) är ett traditionellt kinesiskt medicinskt preparat tillverkat av vattenextraktet från Banlangenroten.8 Förutom sin antivirala effekt uppvisar BLG potentiell antiinflammatorisk aktivitet vid behandling av olika inflammatoriska tillstånd.9,10 Dessutom har glukosinolater (R,S-goitrin, progoitrin, epiprorubin och glukosid isolerats och identifierats från vattenhaltiga extrakt av Radix isatidis) och nukleosider (hypoxantin, adenosin, uridin och guanosin) och indigoalkaloider såsom indigo och indirubin.11,12 Tidigare studier har väl dokumenterat att föreningarna adenosin, uridin och indirubin uppvisar potenta antikoliteffekter i olika djurmodeller av kolit.13-17 Emellertid har inga evidensbaserade studier genomförts för att utvärdera effekten av BLG vid kolit. I den aktuella studien undersökte vi den skyddande effekten av BLG på dextran-natriumsulfat (DSS)-inducerad kronisk återfallande kolit hos C57BL/6-möss. och fann att oral administrering av BLG signifikant dämpade DSS-inducerad kronisk recidiverande koloninflammation hos möss, vars regleringsmekanismer är associerade med modulering av tarmmikrobiotan och återställande av tarmderiverad glukagonliknande peptid-1 (GLP-1) produktion.
BLG-granulat (sockerfritt, NMPA-godkänt Z11020357; Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd., Peking, Kina; batchnummer: 20110966) köptes från apotek. DSS (molekylvikt: 36 000–50 000 Dalton) köptes från MP Biologicals (Santa Ana, USA). Sulfasalazin (SASP) (≥ 98 % renhet), hematoxylin och eosin köptes från Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Mus TNF-α, IL-1β och IL-6 luminex Elisa-analyssatser köptes från R&D Systems (Minneapolis, MN, USA). Ättiksyra, propionsyra och smörsyra köptes från Aladdin Industries (Shanghai, Kina). 2-etylsmörsyra köptes från Merck KGaA (Darmstadt, Tyskland).
6–8 veckor gamla hanmöss av typen C57BL/6 (kroppsvikt 18–22 g) köptes från Beijing Wetahe Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Peking, Kina) och hölls i en miljö på 22 ± 2 °C med en 12 timmars ljus/mörker-cykel. Mössen fick en standardkost för gnagare med fri tillgång till dricksvatten i en vecka för att de skulle acklimatisera sig till den nya miljön. Mössen delades sedan slumpmässigt in i fyra grupper: kontrollgrupp, DSS-modellgrupp, SASP-behandlad grupp (200 mg/kg, oralt) och BLG-behandlad grupp (1 g/kg, oralt). Som visas i figur 1A inducerades experimentell kronisk återfallande kolit hos möss genom tre cykler med 1,8 % DSS i 5 dagar, följt av destillerat vatten i 7 dagar, enligt vår tidigare studie.18 Möss i de SASP- respektive BLG-behandlade grupperna behandlades med SASP respektive BLG varje dag från och med dag 0. Enligt preliminära experiment var dosen av BLG sattes till 1 g/kg. Samtidigt sattes dosen av SASP till 200 mg/kg enligt litteraturen.4 Kontroll- och DSS-modellgrupperna fick samma volym vatten under hela experimentet.
Figur 1 BLG lindrar DSS-inducerad kronisk recidiverande kolit hos möss. (A) Experimentell design av kronisk recidiverande kolit och behandling, (B) förändring av kroppsvikt, (C) sjukdomsaktivitetsindex (DAI) poäng, (D) kolonlängd, (E) representativ bild av kolon, (F) H&E-färgning av kolon (förstoring, ×100) och (G) histologisk poäng. Data presenteras som medelvärde ± SEM (n = 6). ##p < 0,01 eller ###p < 0,001 vs kontrollgrupp (Con); *p < 0,05 eller **p < 0,01 eller ***p < 0,001 vs DSS-grupp.
Kroppsvikt, avföringskonsistens och rektal blödning registrerades dagligen. Sjukdomsaktivitetsindex (DAI) bestämdes genom att kombinera poäng för kroppsvikt, avföringskonsistens och rektal blödning enligt tidigare beskrivning.19 Vid slutet av experimentet avlivades alla möss och blod, avföring och kolon samlades in för vidare experiment.
Kolonvävnad formalinfixerades och inbäddades i paraffin. 5-mikronsnitt gjordes och färgades med hematoxylin-eosin (H&E), sedan blindades och poängsattes enligt tidigare beskrivning.19
Totalt RNA från kolonvävnad extraherades med Trizol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA), följt av cDNA-extraktion med omvänt transkriptas (TaKaRa, Kusatsu, Shiga, Japan). Kvantitativ PCR utfördes med ett realtids-PCR-system med SYBR Green Master (Roche, Basel, Schweiz). Målgentranskript normaliserades till β-aktin och data analyserades med 2-ΔΔCT-metoden. Genprimersekvenserna visas i tabell 1.
Primär isolering och odling av epitelceller från muskolon utfördes enligt tidigare beskrivning.20 Kortfattat skars kolon från 6-8 veckor gamla möss först ut efter avlivning genom cervikal dislokation, öppnades sedan longitudinellt, behandlades med Hanks Balanced Salt Solution (HBSS, utan kalcium och magnesium) och skars i 0,5-1 mm stora små bitar. Därefter digererades vävnaderna med 0,4 mg/ml kollagenas XI (Sigma, Poole, Storbritannien) i fritt DMEM-medium och centrifugerades vid 300 xg i 5 minuter vid rumstemperatur. Resuspendera pelleten i DMEM-medium (kompletterat med 10 % fetalt bovint serum, 100 enheter/ml penicillin och 100 µg/ml streptomycin) vid 37 °C och fördes genom ett nylonnät (porstorlek ~250 µm). Alikvoter av epitelceller från kolon placerades i skålar med glasbotten och inkuberades med ättiksyra, propionsyra, smörsyra och mus- fekala extrakt i 2 timmar vid 37 °C, 5 % CO2.
Kolonvävnad homogeniserades med PBS, och nivåerna av cytokinerna IL-6, TNF-α och IL-1β i kolonvävnad detekterades med hjälp av luminex ELISA-analyssatser (R&D systems, Minneapolis, MN, USA). Likaså bestämdes GLP-1-nivåer i serum och odlingsmedium från primära murina kolonepitelceller med ett ELISA-kit (Bioswamp, Wuhan, Kina) enligt tillverkarens instruktioner.
Totalt DNA från avföring extraherades med hjälp av ett DNA-extraktionskit (Tiangen, Kina). Kvaliteten och kvantiteten av DNA mättes vid förhållandena 260 nm/280 nm respektive 260 nm/230 nm. Därefter användes de specifika primrarna 338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) och 806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT) med varje extraherat DNA som mall för att amplifiera V3-V4-regionerna i 16S rRNA-genen i olika regioner. PCR-produkter renades med QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Tyskland), kvantifierades med realtids-PCR och sekvenserades med hjälp av IlluminaMiseq PE300-sekvenseringsplattformen (Illumina Inc., CA, USA). För bioinformatisk analys utfördes databehandling enligt tidigare rapporterade protokoll.21,22 Kort sagt, använd Cutadapt (V1.9.1) för att filtrera råa expressfiler. OTU:er klustrades med hjälp av UPARSE (version 7.0.1001) med en likhetsgräns på 97 %, och UCHIME användes för att avlägsna chimära sekvenser. Analys och klassificering av gemenskapskomposition utfördes med hjälp av RDP-klassificeraren (http://rdp.cme.msu.edu/) baserat på SILVA ribosomalt RNA-gendatabasen.
Nivåerna av kortkedjiga fettsyror (ättiksyra, propionsyra och smörsyra) mättes enligt tidigare beskrivning av Tao et al., med vissa modifieringar.23 Kortfattat suspenderades först 100 mg avföring i 0,4 ml avjoniserat vatten, följt av 0,1 ml 50 % svavelsyra och 0,5 ml 2-etylsmörsyra (intern standard), homogeniserades sedan och upphettades vid 4 °C. Centrifugera vid 12 000 rpm i 15 minuter vid C. Supernatanten extraherades med 0,5 ml eter och injicerades i GC för analys. För gaskromatografi (GC)-analys analyserades proverna med en GC-2010 Plus gaskromatograf (Shimadzu, Inc.) utrustad med en flamjonisationsdetektor (FID). Separation uppnåddes med en ZKAT-624-kolonn, 30 m × 0,53 mm × 0,3 μm (Lanzhou Zhongke Antai Analytical Technology Co., Ltd., Kina). Data erhölls med GC-lösningsprogramvara (Shimadzu, Inc.). Delningsförhållandet var 10:1, bärgasen var kväve och flödeshastigheten var 6 ml/min. Injektionsvolymen var 1 μL. Injektor- och detektortemperaturen var 300 °C. Ugnstemperaturen hölls vid 140 °C i 13,5 minuter och ökades sedan till 250 °C med en hastighet av 120°C/min; temperaturen hölls i 5 minuter.
Data presenteras som medelvärde ± standardfel för medelvärdet (SEM). Datasignifikans bedömdes med envägs-ANOVA följt av Duncans multipla range-test. GraphPad Prism 5.0-programvara (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) användes för alla beräkningar och p < 0,05 ansågs statistiskt signifikant.
Det är välkänt att UC är en kronisk recidiverande kolitsjukdom med svåra buksmärtor, diarré och blödningar. Därför etablerades DSS-inducerad kronisk recidiverande kolit hos möss för att utvärdera BLG:s antikolit-effekt (Fig. 1A). Jämfört med kontrollgruppen hade möss i DSS-modellgruppen signifikant minskad kroppsvikt och högre DAI, och dessa förändringar var signifikant reverserade efter 24 dagars BLG-behandling (Figur 1B och C). Kolonförkortning är ett viktigt kännetecken för UC. Som visas i Figur 1D och E förkortades kolonlängderna hos möss som fick DSS signifikant, men lindrades av BLG-behandling. Därefter utfördes histopatologisk analys för att bedöma koloninflammation. H&E-färgade bilder och patologiska poäng visade att DSS-administrering signifikant störde kolonarkitekturen och resulterade i kryptförstörelse, medan BLG-behandling signifikant minskade kryptförstörelse och patologiska poäng (Figur 1F och G). Det är värt att notera att den skyddande effekten av BLG vid en dos på 1 g/kg var jämförbar med den för SASP vid en dos på 200 mg/kg. Sammantaget tyder dessa fynd på att BLG är effektivt för att minska svårighetsgraden av DSS-inducerad kronisk recidiverande kolit hos möss.
TNF-α, IL-1β och IL-6 är viktiga inflammatoriska markörer för koloninflammation. Som visas i figur 2A inducerade DSS en signifikant ökning av genuttrycket av TNF-α, IL-1β och IL-6 i tjocktarmen jämfört med kontrollgruppen. Administrering av BLG kan signifikant reversera dessa DSS-medierade förändringar. Därefter använde vi ELISA för att bestämma nivåerna av de inflammatoriska cytokinerna TNF-α, IL-1β och IL-6 i kolonvävnad. Resultaten visade också att kolonnivåerna av TNF-α, IL-1β och IL-6 var signifikant ökade hos möss behandlade med DSS, medan BLG-behandling lindrade dessa ökningar (figur 2B).
Figur 2 BLG hämmar genuttryck och produktion av de proinflammatoriska cytokinerna TNF-α, IL-1β och IL-6 i tjocktarmen hos DSS-behandlade möss. (A) Kolonisk genuttryck av TNF-α, IL-1β och IL-6; (B) Koloniska proteinnivåer av TNF-α, IL-1β och IL-6. Data presenteras som medelvärde ± SEM (n = 4–6). #p < 0,05 eller ##p < 0,01 eller ###p < 0,001 jämfört med kontrollgruppen (Con); *p < 0,05 eller **p < 0,01 jämfört med DSS-gruppen.
Tarmdysbios är avgörande för patogenesen av UC.24 För att undersöka om BLG modulerar tarmfloran hos DSS-behandlade möss utfördes 16S rRNA-sekvensering för att analysera den bakteriella gemenskapen i tarminnehållet. Venn-diagrammet visar att de tre grupperna delar 385 OTU:er. Samtidigt hade varje grupp unika OTU:er (Fig. 3A). Dessutom visade Chao1-indexet och Shannon-indexet som visas i Figur 3B och C att gemenskapsdiversiteten i tarmfloran minskade hos BLG-behandlade möss, eftersom Shannon-indexet minskade signifikant i den BLG-behandlade gruppen. Principal component analysis (PCA) och principal coordinate analysis (PCoA) användes för att bestämma klustermönster bland de tre grupperna och visade att gemenskapsstrukturen hos DSS-behandlade möss var tydligt separerad efter BLG-behandling (Figur 3D och E). Dessa data tyder på att BLG-behandling signifikant påverkade gemenskapsstrukturen hos möss med DSS-inducerad kolit.
Figur 3. BLG förändrar mångfalden i tarmfloran hos möss med DSS-inducerad kolit. (A) Venn-diagram för OTU, (B) Chao1-index, (C) Shannons richness index, (D) Principal Component Analysis (PCA)-poängdiagram för OTU, (E) OTU Principal Coordinate Analysis (PCoA)-poängfigur. Data presenteras som medelvärde ± SEM (n = 6). **p < 0,01 vs DSS-grupp.
För att bedöma specifika förändringar i den fekala mikrobiotan analyserade vi tarmmikrobiotans sammansättning på alla taxonomiska nivåer. Som visas i figur 4A var de huvudsakliga fyla i alla grupper Firmicutes och Bacteroidetes, följt av Verrucomicrobia. De relativa förekomsterna av Firmicutes och Firmicutes/Bacteroidetes-förhållandena ökade signifikant i de fekala mikrobiella samhällena hos DSS-behandlade möss jämfört med kontrollmöss, och dessa förändringar reverserades signifikant efter BLG-behandling. I synnerhet ökade BLG-behandling signifikant den relativa förekomsten av Verrucobacterium i avföringen hos möss med DSS-inducerad kolit. På hushållsnivå ockuperades fekala mikrobiella samhällen av Lachnospiriaceae, Muribaculaceae, Akkermansiaceae, Ruminococcaceae och Prevotellaceae (Fig. 4B). Jämfört med DSS-gruppen ökade utarmningen av BLG förekomsten av Akkermansiaceae, men minskade förekomsten av Lachnospiraceae och Ruminococcaceae. Anmärkningsvärt är att på släktenivå, Den fekala mikrobiotan ockuperades av Lachnospira_NK4A136_gruppen, Akkermansia och Prevotellaceae_UCG-001 (Fig. 4C). Detta fynd visade också att BLG-behandling effektivt reverserade mikrobiotaobalansen som svar på DSS-utmaning, kännetecknad av en minskning av Eubacterium_xylanophilum_gruppen, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas och Oscillibacter, och en ökning av Akkermansia och Prevotellaceae_UCG-001.
Figur 4 BLG förändrar förekomsten av tarmfloran hos möss med DSS-inducerad kolit. (A) Förekomst av tarmflora på fylumnivå; (B) Förekomst av tarmflora på familjenivå; (C) Förekomst av tarmflora på släktenivå. Data presenteras som medelvärde ± SEM (n = 6). #p < 0,05 eller ###p < 0,001 vs kontrollgrupp (Con); *p < 0,05 eller **p < 0,01 eller ***p < 0,001 vs DSS-grupp.
Med tanke på att kortkedjiga fettsyror (SCFA) är de viktigaste metaboliterna av Akkermansia och Prevotellaceae_UCG-001, medan acetat, propionat och butyrat är de vanligaste SCFA:erna i tarmlumen,25-27 är vi fortfarande i vår studie. Som visas i figur 5 minskade koncentrationerna av acetat, propionat och butyrat i fekal vätska signifikant i den DSS-behandlade gruppen, medan BLG-behandling till stor del kunde undertrycka denna minskning.
Figur 5. BLG ökar nivåerna av kortkolsyrade fettsyror i avföringen hos möss med DSS-inducerad kolit. (A) Ättiksyrahalt i avföring; (B) propionsyrahalt i avföring; (C) smörsyrahalt i avföring. Data presenteras som medelvärde ± SEM (n = 6). #p < 0,05 eller ##p < 0,01 vs kontrollgrupp (Con); *p < 0,05 eller **p < 0,01 vs DSS-grupp.
Vi beräknade vidare Pearson-korrelationskoefficienten mellan differentiell SCFA på genusnivå och fekal mikrobiota. Som visas i figur 6 var Akkermansia positivt korrelerad med produktionen av propionsyra (Pearson = 0,4866) och smörsyra (Pearson = 0,6192). Däremot var både Enteromonas och Oscillobacter negativt associerade med acetatproduktion, med Pearson-koefficienter på 0,4709 respektive 0,5104. På samma sätt var Ruminococcaceae_UCG-014 negativt korrelerad med produktionen av propionsyra (Pearson = 0,4508) respektive smörsyra (Pearson = 0,5842).
Figur 6 Pearson-korrelationsanalys mellan differentiella kortkolhydratkalciumhaltiga fettsyror och kolonmikrober. (A) Enteromonas med ättiksyra; (B) Hjärnskakningsbacill med ättiksyra; (C) Akkermansia vs propionsyra; (D) Ruminococcus_UCG-014 med propionsyra; (E) Akkermansia med smörsyra; (F) Ruminococcus _UCG-014 med smörsyra.
Glukagonliknande peptid-1 (GLP-1) är en celltypspecifik posttranslationell produkt av proglukagon (Gcg) med antiinflammatoriska egenskaper.28 Som visas i figur 7 inducerade DSS en signifikant minskning av Gcg mRNA-uttryck. Kolon- och BLG-behandling kunde signifikant reversera den DSS-inducerade Gcg-reduktionen jämfört med kontrollgruppen (figur 7A). Samtidigt minskade nivån av GLP-1 i serum signifikant i den DSS-behandlade gruppen, och BLG-behandling kunde till stor del förhindra denna reduktion (figur 7B). Eftersom kortkedjiga fettsyror kan stimulera GLP-1-sekretion genom aktivering av G-proteinkopplad receptor 43 (GRP43) och G-proteinkopplad receptor 41 (GRP41), undersökte vi också GPR41 och GRP43 i kolon hos kolitmöss och fann att kolon-mRNA-uttrycket av GRP43 och GPR41 minskade signifikant efter DSS-exponering, och BLG-behandling kunde effektivt åtgärda dessa minskningar (figur 7C och D).
Figur 7 BLG ökar serumnivåerna av GLP-1 och mRNA-uttrycket av Gcg, GPR41 och GRP43 i kolon hos DSS-behandlade möss. (A) Gcg mRNA-uttryck i kolonvävnad; (B) GLP-1-nivå i serum; (C) GPR41 mRNA-uttryck i kolonvävnad; (D) GPR43 mRNA-uttryck i kolonvävnad. Data presenteras som medelvärde ± SEM (n = 5–6). #p < 0,05 eller ##p < 0,01 jämfört med kontrollgruppen (Con); *p < 0,05 jämfört med DSS-gruppen.
Eftersom BLG-behandling kunde öka serumnivåerna av GLP-1, uttrycket av Gcg mRNA i kolon och nivåerna av SCFA i feces hos DSS-behandlade möss, undersökte vi vidare acetat, propionat och butyrat samt från kontrollmöss (F-Con), DSS-kolit (F-Con)-DSS) och BLG-behandlade kolit (F-BLG) gällande frisättningen av GLP-1 från primära murina kolonepitelceller. Som visas i figur 8A stimulerade primära muskolonepitelceller behandlade med 2 mM ättiksyra, propionsyra respektive smörsyra signifikant frisättningen av GLP-1, vilket överensstämmer med tidigare studier.29,30 Likaså stimulerade alla F-Con, F-DSS och F-BLG (motsvarande 0,25 g avföring) i hög grad frisättningen av GLP-1 från primära murina kolonepitelceller. Det är värt att notera att mängden GLP-1 som frisattes av F-DSS-behandlade primära muskolonepitelceller var mycket lägre än den för F-Con. och F-BLG-behandlade primära muskolonepitelceller. (Figur 8B). Dessa data tyder på att BLG-behandling signifikant återställde intestinal SCFA-deriverad GLP-1-produktion.
Figur 8 BLG-deriverad SCFA stimulerar frisättningen av GLP-1 från primära murina kolonepitelceller. (A) Ättiksyra, propionsyra och smörsyra stimulerade frisättningen av GLP-1 från primära murina kolonepitelceller; (B) fekala extrakt F-Con, F-DSS och F-BLG stimulerade primära murina kolonepitelceller Mängd frisatt GLP-1. Alikvoter av kolonepitelceller placerades i petriskålar med glasbotten och behandlades med 2 mM ättiksyra, propionsyra, smörsyra respektive fekala extrakt F-Con, F-DSS respektive F-BLG (motsvarande 0,25 g feces). 2 timmar vid 37°C, 5 % CO2. Mängden GLP-1 som frisattes från primära murina kolonepitelceller detekterades med ELISA. Data presenteras som medelvärde ± SEM (n = 3). #p < 0,05 eller ##p < 0,01 vs. blank eller F-Con; *p < 0,05 vs. F-DSS.
Förkortningar: Ace, ättiksyra; Pro, propionsyra; dock smörsyra; F-Con, fekalt extrakt från kontrollmöss; F-DSS, fekalt extrakt från kolitmöss; F-BLG, från BLG-behandlad kolon. Fekalt extrakt från inflammatoriska möss.
Colitis ulcerosa, som listas av Världshälsoorganisationen som en refraktär sjukdom, håller på att bli en global fara; Effektiva metoder för att förutsäga, förebygga och behandla sjukdomen är dock fortfarande begränsade. Därför finns det ett akut behov av att utforska och utveckla nya säkra och effektiva terapeutiska strategier för UC. Traditionella kinesiska medicinpreparat är ett lovande alternativ eftersom många traditionella kinesiska medicinpreparat har visat sig vara effektiva vid behandling av UC i den kinesiska befolkningen under århundradena, och de är alla biologiska organiska och naturliga material som mestadels är ofarliga för människor och djur.31,32 Denna studie syftade till att söka ett säkert och effektivt traditionellt kinesiskt medicinpreparat för behandling av UC och att utforska dess verkningsmekanism. BLG är en välkänd kinesisk örtformel som används för att behandla influensa.8,33 Arbete i vårt laboratorium och andra har visat att indigo, en bearbetad traditionell kinesisk medicinprodukt från samma råmaterial som BLG, uppvisar betydande effekt vid behandling av UC hos människor och djur.4,34 Emellertid är BLG:s antikoliteffekter och dess effekter Mekanismen oklar. I den aktuella studien visar våra resultat att BLG effektivt dämpar DSS-inducerad koloninflammation, vilket är förknippat med modulering av tarmfunktionen. mikrobiota och återställande av tarmderiverad GLP-1-produktion.
Det är välkänt att UC kännetecknas av återkommande perioder med typiska kliniska särdrag, såsom viktminskning, diarré, rektal blödning och omfattande skador på kolonslemhinnan.35 Således administrerades kronisk återkommande kolit genom att administrera tre cykler av 1,8 % DSS i fem dagar, följt av sju dagars dricksvatten. Som visas i figur 1B indikerade fluktuerande viktminskning och DAI-poäng framgångsrik induktion av kronisk återkommande kolit. Möss i gruppen som behandlades med BLG uppvisade uppåtgående återhämtning från dag 8, vilket skilde sig signifikant från dag 24. Samma förändringar observerades också i DAI-poängen, vilket tyder på en förbättring av den kliniska förbättringen av kolit. När det gäller kolonskada och inflammatorisk status förbättrades kolonlängd, kolonvävnadsskada samt genuttryck och produktion av de proinflammatoriska cytokinerna TNF-α, IL-1β och IL-6 i kolonvävnad också kraftigt efter BLG-behandling. Sammantaget visar dessa resultat tydligt att BLG är effektivt vid behandling av kronisk återkommande kolit hos möss.
Hur utövar BLG sina farmakologiska effekter? Många tidigare studier har visat att tarmfloran spelar en nyckelroll i patogenesen av UC, och mikrobiombaserade och mikrobiomriktade terapier har framkommit som en mycket attraktiv strategi för behandling av UC. I den aktuella studien visade vi att BLG-behandling resulterade i signifikanta förändringar i tarmflorans sammansättning, vilket tyder på att den skyddande effekten av BLG mot DSS-inducerad kolit är relaterad till modulering av tarmfloran. Denna observation överensstämmer med uppfattningen att omprogrammering av tarmflorans homeostas är ett viktigt tillvägagångssätt för att förstå effekten av TCM-preparat.36,37 Det är värt att notera att Akkermansia är en gramnegativ och strikt anaerob bakterie som lever i tarmens slemlager, vilket bryter ner muciner, producerar propionsyra, stimulerar bägarcellsdifferentiering och upprätthåller slemhinnans barriärfunktion.26 Flera kliniska och djurdata tyder på att Akkermansia är starkt associerat med frisk slemhinna38 och oral administrering av Akkermansia spp. kan avsevärt förbättra slemhinneinflammation.39 Våra nuvarande data tyder på att den relativa förekomsten av Akkermansia ökar signifikant efter BLG-behandling. Dessutom är Prevotellaceae_UCG-001 en SCFA-producerande bakterie.27 Flera studier visade att Prevotellaceae_UCG-001 hittades i låg relativ förekomst i avföringen från djur med kolit.40,41 Våra nuvarande data visar också att BLG-behandling kan öka den relativa förekomsten av Prevotellaceae_UCG-001 i tjocktarmen hos DSS-behandlade möss avsevärt. Däremot är Oscillibacter en mesofil, strikt anaerob bakterie.42 rapporterade att den relativa förekomsten av Oscillibacter var signifikant ökad hos UC-möss och var signifikant positivt korrelerad med IL-6- och IL-1β-nivåer och patologiska poäng.43,44 Det är värt att notera att BLG-behandling signifikant minskade den relativa förekomsten av Oscillibacter i avföringen hos DSS-behandlade möss. Det är värt att notera att dessa BLG-förändrade bakterier var de mest SCFA-producerande bakterierna. Många tidigare studier har visat de potentiellt gynnsamma effekterna av SCFA. på koloninflammation och skydd av tarmepitelets integritet.45,46 Våra nuvarande data observerade också att koncentrationerna av SCFA-acetat, propionat och butyrat i DSS-behandlad avföring var kraftigt förhöjda hos BLG-behandlade möss. Sammantaget visar dessa fynd tydligt att BLG-behandling effektivt kan förbättra DSS-inducerade SCFA-producerande bakterier hos möss med kronisk recidiverande kolit.
GLP-1 är ett inkretin som huvudsakligen produceras i ileum och tjocktarmen och spelar en viktig roll för att fördröja magtömning och sänka postprandialt blodsocker.47 Det finns bevis som tyder på att dipeptidylpeptidas (DPP)-4, en GLP-1-receptoragonist och en GLP-1-nanomedicin effektivt kan lindra tarminflammation hos möss.48-51 Som rapporterats i tidigare studier var höga SCFA-koncentrationer associerade med plasmanivåer av GLP-1 hos människor och möss.52 Våra nuvarande data visar att efter BLG-behandling ökade serumnivåerna av GLP-1 och Gcg mRNA-uttryck signifikant. På samma sätt ökade GLP-1-sekretionen signifikant i kolonkulturer efter stimulering med fekala extrakt från BLG-behandlade kolitmöss jämfört med stimulering med fekala extrakt från DSS-behandlade kolitmöss.Hur påverkar SCFA frisättningen av GLP-1?Gwen Tolhurst et al. rapporterade att SCFA kan stimulera GLP-1-sekretion genom GRP43 och GPR41.29 Våra nuvarande data visar också att BLG-behandling signifikant ökar mRNA-uttrycket av GRP43 och GPR41 i kolon hos DSS-behandlade möss. Dessa data tyder på att BLG-behandling kan återställa SCFA-främjad GLP-1-produktion genom att aktivera GRP43 och GPR41.
BLG är ett långtidsreceptfritt läkemedel i Kina. Den maximalt tolererade dosen av BLG hos Kunming-möss är 80 g/kg, och ingen akut toxicitet har observerats.53 För närvarande är den rekommenderade dosen av BLG (utan socker) hos människor 9–15 g/dag (3 gånger per dag). Vår studie visade att BLG vid 1 g/kg lindrade DSS-inducerad kronisk recidiverande kolit hos möss. Denna dos ligger nära den BLG-dos som används kliniskt. Vår studie fann också att dess verkningsmekanism medieras, åtminstone delvis, av förändringar i tarmfloran, särskilt SCFA-producerande bakterier, såsom Akkermansia och Prevotellaceae_UCG-001, för att återställa tarm-deriverad GLP-1-produktion. Dessa fynd tyder på att BLG förtjänar ytterligare övervägande som ett potentiellt terapeutiskt medel för klinisk kolitbehandling. Den exakta mekanismen genom vilken det modulerar tarmfloran återstår dock att bekräftas av möss med mikrobiotabrist och fekal bakterietransplantation.
Ättiksyra; smörsyra; pandan; dextran, natriumsulfat; DAI; sjukdomsaktivitetsindex; DPP, dipeptidylpeptidas; FID, flamjonisationsdetektor; F-Con, kontroll. Fekala extrakt från möss; F-DSS, fekala extrakt från möss med DSS-kolit; F-BLG, fekala extrakt från möss med BLG-behandlad kolit; GLP-1, glukagonliknande peptid-1; Gcg, glukagon; gaskromatografi; GRP43, G-proteinkopplad receptor 43; GRP41, G-proteinkopplad receptor 41; H&E, hematoxylin-eosin; HBSS, Hanks balanserade saltlösning; OTC; PCA, principalkomponentanalys; PCoA, principalkoordinatanalys; Pro, propionsyra; SASP, sulfasalazin; SCFA, kortkedjiga fettsyror; kinesisk medicin, traditionell kinesisk medicin; UC, ulcerös kolit.
Alla experimentella protokoll godkändes av djuretikkommittén vid Peking University Shenzhen-Hong Kong University of Science and Technology Medical Center (Shenzhen, Kina) enligt de institutionella riktlinjerna och djurföreskrifterna (etiknummer A2020157).
Alla författare har bidragit väsentligt till koncept och design, datainsamling eller dataanalys och tolkning; deltog i utarbetandet av artikeln eller kritiskt granskade viktigt intellektuellt innehåll; gick med på att skicka in manuskriptet till den aktuella tidskriften; godkände slutligen versionen för publicering; Ansvarade för alla aspekter av arbetet.
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (81560676 och 81660479), det förstklassiga projektet från Shenzhen University (86000000210), Shenzhen Science and Technology Innovation Committee Fund (JCYJ20210324093810026), och Guangdong Provincial Medical Science and Technology Research Fund (A2020157 och A2020272), Guizhou Medical University Pharmacy Guizhou Province Financed by Key Laboratory (YWZJ2020-01) och Peking University Shenzhen Hospital (JCYJ2018009).
1. Tang B, Zhu J, Zhang B, et al. Terapeutisk potential av triptolid som ett antiinflammatoriskt medel vid dextran-natriumsulfat-inducerad experimentell kolit hos möss. pre-immune.2020;11:592084.doi: 10.3389/fimmu.2020.592084
2. Kaplan GG. Den globala bördan av IBD: från 2015 till 2025. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2015;12:720–727.doi: 10.1038/nrgastro.2015.150
3. Peng J, Zheng TT, Li Xue, et al. Växtbaserade alkaloider: lovande sjukdomsmodifierare vid inflammatorisk tarmsjukdom. Prepharmacology.2019;10:351.doi:10.3389/fphar.2019.00351
4. Xiao Haiteng, Peng Jie, Wen B, et al. Indigo Naturalis hämmar oxidativ stress i kolon och Th1/Th17-svar vid DSS-inducerad kolit hos möss. Oxid Med Cell Longev. 2019;2019:9480945.doi: 10.1155/2019/9480945
5. Chen M, Ding Y, Tong Z. Effekt och säkerhet för Sophora flavescens (Sophora flavescens) kinesisk örtmedicin vid behandling av ulcerös kolit: kliniska bevis och potentiella mekanismer. Prepharmacology.2020;11:603476.doi:10.3389/fphar.2020.603476
6. Cao Fang, Liu Jie, Sha Benxing, Pan HF. Naturprodukter: experimentellt effektiva läkemedel för behandling av inflammatorisk tarmsjukdom. Curr Pharmaceuticals. 2019;25:4893–4913.doi: 10.2174/1381612825666191216154224
7. Zhang C, Jiang M, Lu A. Reflektioner kring adjuvant behandling av ulcerös kolit med traditionell kinesisk medicin. Clinical Rev Allergy Immunization. 2013;44:274–283.doi: 10.1007/s12016-012-8328-9
8. Li Zhongteng, Li Li, Chen TT, et al. Effekt och säkerhet för Banlangen-granulat vid behandling av säsongsinfluensa: ett studieprotokoll för en randomiserad kontrollerad studie. trial.2015;16:126.doi: 10.1186/s13063-015-0645-x