Proteinsortering i den sekretoriska vägen är avgörande för att upprätthålla cellkompartmentalisering och homeostas. Förutom skalmedierad sortering är lipidernas roll i kinesinsortering i processen för sekretorisk transport en långvarig grundläggande fråga som ännu inte har besvarats. Här utför vi 3D-simultan flerfärgs högupplöst realtidsavbildning för att bevisa in vivo att nysyntetiserade glykosylfosfatidylinositol-immobiliserade proteiner med mycket långa ceramidlipidenheter är klustrade och klassificerade i specialiserade endoplasmers net exit-ställe, vilket skiljer sig från det som används av transmembranproteiner. Dessutom visar vi att kedjelängden för ceramid i det endoplasmatiska retikulummembranet är avgörande för denna sorteringsselektivitet. Vår studie ger de första direkta in vivo-bevisen för att klassificera proteinlaster baserat på lipidkedjelängd i selektiva exportställen i den sekretoriska vägen.
I eukaryota celler sorteras de proteiner som syntetiseras i endoplasmatiskt retikulum (ER) sedan under transport genom den sekretoriska vägen för leverans till deras lämpliga cellulära destination (1). Förutom höljesmedierad sortering har det länge spekulerats i att vissa lipider också kan fungera som selektiva utgångspunkter genom att klustra dem i specifika membrandomäner som specifika proteiner (2-5). Det saknas dock fortfarande direkta in vivo-bevis för att bevisa denna möjliga lipidbaserade mekanism. För att lösa detta grundläggande problem studerade vi i jäst hur glykosylfosfatidylinositol (GPI) förankrade proteiner (GPI-AP) exporteras differentiellt från ER. GPI-AP är en mängd olika lipidkopplade cellyteproteiner (6, 7). GPI-AP är ett utsöndrat protein fäst vid de yttre lamellerna i plasmamembranet genom glykolipiddelen (GPI-ankare). De accepterar GPI-ankare som konservativa posttranslationella modifieringar i ER-lumen (8). Efter vidhäftning passerar GPI-AP genom Golgi-apparaten (5, 9) från ER till plasmamembranet. Närvaron av GPI-ankare gör att GPI-AP transporteras separat från transmembranutsöndrade proteiner (inklusive andra plasmamembranproteiner) längs den sekretoriska vägen (5, 9, 10). I jästceller separeras GPI-AP från andra utsöndrade proteiner i endoplasmatiskt retikulum och packas sedan i unika vesiklar omslutna av höljesproteinkomplex II (COPII) (6, 7). Faktorerna som bestämmer denna klassificeringsprocess i ER-exportprocessen är oklara, men det spekuleras att denna mekanism kan kräva lipider, särskilt strukturell ombyggnad av lipiddelen av GPI-ankaret (5, 8). I jäst börjar GPI-lipidombyggnad omedelbart efter att GPI fäster, och i många fall orsakar det att ceramid binder till den 26-kolatomers långkedjiga mättade fettsyran (C26:0) (11, 12). C26-ceramid är den huvudsakliga ceramid som hittills produceras av jästceller. Den syntetiseras i ER och det mesta exporteras till Golgi-apparaten via COPII-vesiklar (13). Exporten av GPI-AP till ER kräver specifikt kontinuerlig ceramidsyntes (14, 15), och i sin tur är omvandlingen av ceramid till inositolfosfatceramid (IPC) i Golgi-apparaten beroende av GPI-ankarsyntes (16). Biofysiska studier med artificiella membran har visat att mycket långa acylkedjiga ceramider kan koalescera för att bilda ordnade domäner med unika fysikaliska egenskaper (17, 18). Dessa data leder till hypotesen att C26-ceramid och GPI-AP med C26-ceramid använder sina fysikaliska egenskaper för att koalescera till ordnade regioner eller regioner i den relativt röriga ER-membranlipidmiljön. Den består huvudsakligen av korta och omättade glycerolipider (C16:1 och C18:1) (19, 20). Dessa regioner kommer att selektivt fokuseras på specifika ER-utgångsställen (ERES), där ceramid och ceramidbaserad GPI-AP kan samtransporteras till Golgi i samma dedikerade COPII-vesikel (5).
I denna studie har vi direkt testat denna lipidbaserade mekanism med hjälp av superupplösningskonfokal realtidsavbildningsmikroskopi (SCLIM), vilket är en banbrytande mikroskopiteknik som samtidigt kan observera fluorescerande märkta proteiner. De trefärgade och tredimensionella (3D) bilderna har extremt hög upplösning och hastighet i levande celler (21, 22).
Vi använde först SCLIM-teknik för att ytterligare definiera hur normal GPI-AP med C26-ceramidgrupp screenades från transmembranutsöndrade proteiner efter att ha lämnat ER i S. cerevisiae. För att kontrollera klassificeringen av ER använde vi ett genetiskt system som direkt kan visualisera nysyntetiserad last som kommer in i ERES in vivo (7, 23). Som last valde vi C26-ceramidbaserad GPI-AP Gas1 märkt med grönt fluorescerande protein (GFP) och transmembranutsöndrat protein Mid2 märkt med nära-infrarött fluorescerande protein (iRFP), vilka båda riktar sig mot plasmamembranet (24–26). I den temperaturkänsliga mutanten sec31-1 uttrycks dessa två laster under en galaktosinducerbar promotor och en konstitutiv ERES-markör. Vid extrem temperatur (37 °C), eftersom sec31-1-mutationen påverkar funktionen av COPII-höljekomponenten Sec31 att hämma COPII-groning och ER-export, ackumuleras nysyntetiserad last vid ER (23). Efter kylning till låg temperatur (24 °C) återhämtade sig sec31-1-mutantcellerna från det sekretoriska området, och den ackumulerade nya syntetiska lasten började exporteras från ER. CLIM-visualisering visade att det mesta av det nyligen syntetiserade Gas1-GFP och Mid2-iRFP fortfarande ackumulerades i ER hos sec31-1-mutantcellerna efter inkubation vid 37 °C och sedan frisättning vid 24 °C i 5 minuter (Figur 1). Eftersom Mid2-iRFP är distribuerat över hela ER-membranet, och Gas1-GFP är koncentrerat och samlat i det diskontinuerliga ER-membranområdet, är deras distribution helt annorlunda (Figur 1, A till C och Film S1). Dessutom, som visas i Figur 1D, har Gas1-GFP-klustret inte Mid2-iRFP. Dessa resultat indikerar att GPI-AP och transmembranproteiner separerades tidigt i olika ER-membranregioner. Gas1-GFP-klustret ligger intill ett specifikt ERES märkt med mCherrys COPII-höljeprotein Sec13 (Figur 1, E och F, och film S1) (23).
sec31-1-celler uttrycker galaktosinducerade sekret, en lång acylkedjig (C26) ceramid GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, grön) och transmembranproteinet Mid2-iRFP (TMP, blå) och denna konstruktiva ERES-märkning Sec13-mCherry (ERES, magenta) inkuberades vid 37 °C i 30 minuter, flyttades till 24 °C och avbildades med SCLIM 5 minuter senare. (A till C) visar en representativ sammanslagen eller enskild 2D-bild av ett plan (A), en 2D-projektionsbild av 10 z-sektioner (B) eller en 3D-cellhemisfärbild av last och ERES-markörer (C). Skalstreck 1 μm (A och B). Skalenheten är 0,551 μm (C). Gas1-GFP detekterades i diskreta ER-regioner eller kluster, medan Mid2-iRFP detekterades och distribuerades genom ER-membranet (C). (D) Grafen visar den relativa fluorescensintensiteten för Gas1-GFP och Mid2-iRFP i Gas1-GFP-klustret längs den vita pillinjen (vänster). AU, godtycklig enhet. (E och F) representerar 3D-bilden som kombinerar varorna och ERES-märket. Gas1-GFP-kluster detekterades nära den specifika ERES. Skalenheten är 0,551 μm. (F) Den vita, heldragna pilen markerar Gas1-GFP-klustret associerat med ERES. De mellersta och högra panelerna visar den sammanslagna förstorade 3D-bilden och en roterad vy av det valda Gas1-GFP-klustret.
Det nära rumsliga förhållandet mellan Gas1-GFP-klustret och ett specifikt ERES indikerar att Gas1-GFP kan komma in i selektivt ERES, vilket skiljer sig från den selektivitet som används av Mid2-iRFP för att lämna ER. För att undersöka denna möjlighet kvantifierade vi ERES-förhållandet för endast ett eller två gods (Figur 2, A till C). Vi fann att de flesta ERES (70 %) endast innehåller en typ av last. Den nedre bilden i Figur 2C visar två typiska exempel på ERES med endast Gas1-GFP (Figur 1) eller endast Mid2-iRFP (Figur 2). Däremot innehåller cirka 20 % av ERES två laster som överlappar varandra i samma område. Det visade sig att en del ERES (10 %) innehöll två typer av last, men de isolerades i tydligt olika områden. Därför visar denna statistiska analys att efter att ER har exporterats är GPI-AP Gas1-GFP och den transmembrana lasten Mid2-iRFP uppdelade i olika ERES (Figur 2D). Denna sorteringseffektivitet överensstämmer mycket med den tidigare biokemiska analysen (6) och morfologiska bestämningen (7). Vi kan också observera beteendet hos den karantänsatta lasten som kommer in i ERES (Figur 2E och Film S2). Figur 2E visar att endast en liten del av Gas1-GFP (panel 3) eller Mid2-iRFP (panel 4) kommer in i ERES från ena sidan och är begränsad till ett separat område. Panel 5 i Figur 2E visar att Gas1-GFP och Mid2-iRFP ibland finns i samma ERES, men de kommer in från olika sidor och är koncentrerade i separata regioner som kan representera olika COPII-vesiklar. Vi bekräftade också att den observerade separationen och klassificeringen av C26-ceramidbaserad GPI-AP Gas1 som selektiv ERES är specifik eftersom en annan transmembransekretionslast, det GFP-märkta plasmamembranproteinet Axl2 (27), uppvisar liknande beteende som Mid2-iRFP. (Bild S1 och Film S3). Det nyligen syntetiserade Axl2-GFP distribueras genom ER-membranet likt Mid2-iRFP (Figur S1, A och B), och är kolokaliserat med Mid2-iRFP i de flesta ERES (Figur S1, B till D). Panelerna 1 och 2 i Figur 1. S1C visar två typiska exempel på ERES där två transmembrana laster överlappar varandra. I dessa fall kommer båda godsen in i ERES tillsammans (Figur S1E, Panel 3 och Film S3).
Sec31-1-cellerna som uttrycker galaktosinducerbara sekret, Gas1-GFP (GPI-AP, grön) och Mid2-iRFP (TMP, blå) och konstitutiv ERES-märkning Sec13-mCherry (ERES, magenta) placerades vid 37 °C. Efter inkubation i 30 minuter vid °C, flyttades till 24 °C för att frigöra sekretionsblocket och avbildades med SCLIM efter 20 minuter. (A till C) Representativa 2D-projektionsbilder (A; skalstreck, 1 μm) eller 3D-cellhemisfärbilder (B och C; skalenhet, 0,456 μm) av lasten och 10 z-sektioner markerade med ERES. Den nedre panelen i (B) och panelen i (C) visar bearbetade bilder för att endast visa de varor som finns i ERES (magenta) [Gas1-GFP (grå) och Mid2-iRFP (ljusblå)]. (C) Öppen pil: ERES transporterar endast ett laststycke (1 till 4). Grå pil: ERES innehåller segregerad last (5). Vit heldragen pil: ERES innehåller samlokaliserad last. Nedan: Den valda enskilda ERES innehåller endast Gas1-GFP (1) eller Mid2-iRFP (2). Skalstreck, 100 nm. (D) Kvantifiering av fotomikrografen som beskrivs i (C). Den genomsnittliga andelen ERES som endast innehåller en last (Gas1-GFP eller Mid2-iRFP), segregerad last och överlappande last. I tre oberoende experiment, n = 432 i 54 celler. Felstreck = SD. Tvåsidigt oparat t-test. *** P = 0,0002. (E) 3D-bild av vald ERES av karantänlast markerad med (C). Gas1-GFP (grön) (3) eller Mid2-iRFP (blå) (4) kommer in i ERES (magenta) från ena sidan och är begränsad till ett litet område inom ERES. Ibland kommer båda typerna av last in i samma ERES (5) från samma sida och är begränsade till ett isolerat område inom ERES. Skalstreck, 100 nm.
Därefter testade vi hypotesen att den långkedjiga ceramiden (C26) som finns i ER-membranet driver den specifika klustringen och sorteringen av Gas1 till selektiv ERES. För detta ändamål använde vi en modifierad jäststam GhLag1, där de två endogena ceramidsyntaserna Lag1 och Lac1 ersattes av GhLag1 (Lag1-homologen till bomull), vilket resulterade i en jäststam med en cellmembran-ceramidstam kortare än vildtypen (Figur 3A) (28). Masspektrometrianalys (MS) visade att i vildtypstammar är 95 % av den totala ceramiden mycket långkedjig (C26) ceramid, medan i GhLag1 är 85 % av ceramiden mycket långkedjig (C18 och C16), endast 2 % av ceramiden är mycket långkedjig (C26) ceramid. Även om C18- och C16-ceramider är de huvudsakliga ceramider som hittills detekterats i GhLag1-membranet, bekräftade MS-analys också att GPI-ankaret i Gas1-GFP uttryckt i GhLag1-stammen innehåller C26-ceramid, vilket är jämförbart med vildtypslipider. Kvaliteten är densamma (Fig. 3A) (26). Därför betyder detta att ceramidombyggnadsenzymet Cwh43 är mycket selektivt för C26-ceramid, vilket visas i Figur 26, och det inkorporerar företrädesvis GPI-ankaret från en liten mängd C26-ceramid i GhLag1-stammen. S2 (29). Ändå innehåller cellmembranet i GhLag1 i princip bara C18-C16-ceramid, medan Gas1-GFP fortfarande har C26-ceramid. Detta faktum gör denna stam till ett idealiskt verktyg för att specifikt lösa problemet med acylkedjelängden hos membranceramid i ER. Den hypotetiska rollen för klass och sortering. Sedan studerade vi först förmågan hos C26 Gas1-GFP att ackumuleras i kluster i GhLag1 med en temperaturkänslig mutantallel av sec31-1 genom konventionell fluorescensmikroskopi, där endast den långa (C18-C16) kedjan existerar i ER-membranet Ceramid (Fig. 3). Vi observerade att i sec31-1 var det mesta av Gas1-GFP koncentrerat i kluster, medan Gas1-GFP i sec31-1 GhLag1 med långt (C18-C16) långt ceramid-ER-membran huvudsakligen inte var klustrat och distribuerat i hela ER-membranet. För att vara exakt, eftersom C26-ceramidbaserad klustring är nära relaterad till specifik ERES (Figur 1), undersökte vi sedan om denna process också kan involvera funktionen av ER-exportproteinmekanismen. GPI-AP använder ett speciellt COPII-system för ER-export, vilket aktivt regleras av Ted1:s strukturella ombyggnad av glykandelen av GPI-ankaret (30, 31). Det rekombinanta GPI-glykanet känns sedan igen av det transmembrana cargoreceptorkomplexet p24, vilket i sin tur selektivt rekryterar Lst1, vilket är en specifik isoform av den huvudsakliga COPII-cargobindningssubenheten Sec24, vilket bildar en GPI-AP-rik COPII. Vesiklar är nödvändiga (31-33). Därför konstruerade vi en dubbelmutant som kombinerade deletionen av dessa enskilda proteiner (p24-komplexkomponenten Emp24, GPI-glykan-ombyggnadsenzymet Ted1 och den specifika COPII-subenheten Lst1) med sec31-1-mutantstammen, och studerade om det är möjligt att bilda Gas1-kluster-GFP (Figur 3). Vi observerade att i sec31-1emp24Δ och sec31-1ted1Δ är Gas1-GFP huvudsakligen oklustrad och distribuerad i hela ER-membranet, som tidigare setts i sec31-1 GhLag1, medan i sec31-1lst1Δ är Gas1-GFP likt sec31-1. Dessa resultat indikerar att utöver närvaron av C26-ceramid i ER-membranet, behöver klustringen av Gas1-GFP också binda till p24-komplexet och kräver inte specifik Lst1-rekrytering. Sedan undersökte vi möjligheten att kedjelängden för ceramid i ER-membranet kan reglera bindningen av Gas1-GFP till p24. Vi fann dock att närvaron av C18-C16-ceramid i membranet inte påverkar GPI-glykanerna som rekonstrueras av p24-komplexet (Figur S3 och S4, A och B) eller bindningen till GPI-AP och exportförmågan hos GPI-AP. Rekrytera COPII-subtypen Lst1 (Figur S4C). Därför kräver C26-ceramidberoende klustring inte proteininteraktioner med olika ER-exportproteinmekanismer, utan stöder en alternativ sorteringsmekanism som drivs av lipidlängd. Sedan analyserade vi om ceramidacylkedjelängden i ER-membranet är viktig för en effektiv klassificering av Gas1-GFP som selektiv ERES. Eftersom Gas1 i GhLag1-stammen med kortkedjig ceramid lämnar ER och går in i plasmamembranet (Figur S5), tror vi att om sorteringen styrs av längden på ceramidacylkedjan, kan Gas1 i GhLag1-stammen omdirigeras och korsas. ERES-gods med samma membran.
(A) Cellmembranet i GhLag1 innehåller huvudsakligen kortare C18-C16-ceramider, medan GPI-ankaret i Gas1-GFP fortfarande har samma C26 IPC som vildtypsceller. Ovan: acylkedjelängdsanalys av ceramid i cellmembranet hos vildtyps- (Wt) och GhLag1p-stammar med masspektrometri (MS). Data representerar procentandelen total ceramid. Medelvärdet av tre oberoende experiment. Felstapel = SD. Tvåsidigt oparat t-test. **** P <0,0001. Nedre panelen: MS-analys av acylkedjelängden för IPC närvarande i Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI-ankaret uttryckt i vildtyps- och GhLag1p-stammarna. Data representerar procentandelen total IPC-signal. Medelvärdet av fem oberoende experiment. Felstapel = SD. Tvåsidigt oparat t-test. ns, ej viktigt. P = 0,9134. (B) Fluorescensmikrografer av sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ och sec31-1lst1Δ celler som uttrycker galaktosinducerad Gas1-GFP inkuberades vid 37 °C i 30 minuter och skickades vidare till 24 °C. Utför rutinmässig fluorescensmikroskopi efter 24 °C. Vit pil: ER Gas1-GFP-kluster. Öppen pil: Oklustrad Gas1-GFP är fördelad över hela ER-membranet, vilket visar den karakteristiska ER-kärnringfärgningen. Skalstreck, 5 μm. (C) Kvantifiering av fotomikrografen som beskrivs i (B). Den genomsnittliga andelen celler med punktformad Gas1-GFP-struktur. I tre oberoende experiment, n≥300 celler. Felstreck = SD. Tvåsidigt oparat t-test. **** P <0,0001.
För att direkt lösa detta problem utförde vi SCLIM-visualisering av Gas1-GFP och Mid2-iRFP i GhLag1 med den temperaturkänsliga mutantallelen sec31-1 (Figur 4 och Film S4). Efter att ER bibehållits vid 37 °C och därefter frigjorts vid 24 °C, klustrades och distribuerades inte det mesta av det nyligen syntetiserade Gas1-GFP i hela ER-membranet, vilket observerats med konventionella mikroskop (Figur 4, A och B). Dessutom inkluderar en stor andel av ERES (67 %) två typer av last som samlokaliseras i det (Figur 4D). Panelerna 1 och 2 i Figur 4C visar två typiska exempel på ERES med överlappande Gas1-GFP och Mid2-GFP. Dessutom rekryterades båda varorna till samma ERES (Figur 4E, panel 3 och Film S4). Därför indikerar våra resultat att längden på ceramidacylkedjan i ER-membranet är en viktig faktor för ER-proteinaggregering och klassificering.
Sec31-1 GhLag1-celler som uttrycker galaktosinducerade sekret, Gas1-GFP (GPI-AP, grön) och Mid2-iRFP (TMP, blå) och konstitutiv ERES-märkt Sec13-mCherry (ERES, magenta). Inkubera vid 37 °C. Fortsätt i 30 minuter, sänk till 24 °C för att frigöra sekret och avbilda med SCLIM efter 20 minuter. (A till C) Representativa 2D-projektionsbilder (A; skalstreck, 1 μm) eller 3D-cellhemisfärbilder (B och C; skalenhet, 0,45 μm) av de 10 z-sektionerna markerade med last och ERES. Den nedre panelen i (B) och panelen i (C) visar bearbetade bilder för att endast visa de varor som finns i ERES (magenta) [Gas1-GFP (grå) och Mid2-iRFP (ljusblå)]. (C) Vitfylld pil: ERES, varor överlappar varandra. Öppen pil: ERES innehåller endast ett objekt. Nedre panel: Den valda ERES har överlappande varor (1 och 2) markerade i (C). Skalstreck, 100 nm. (D) Kvantifiering av fotomikrografen som beskrivs i (C). I sec31-1- och sec31-1 GhLag1-enheterna ingår endast en last (Gas1-GFP eller Mid2-iRFP), och den genomsnittliga procentandelen ERES för isolerad last och överlappande last. I tre oberoende experiment, n = 432 i 54 celler (sec31-1) och n = 430 i 47 celler (sec31-1 GhLag1). Felstreck = SD. Tvåsidigt oparat t-test. *** P = 0,0002 (sec31-1) och ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) 3D-bild av vald ERES med överlappande last (3) markerad i (C). Gas1-GFP (grön) och Mid2-iRFP (blå) närmar sig ERES (magenta) från samma sida och håller sig inom samma ERES-begränsade område. Skalstreck, 100 nm.
Denna studie ger direkta in vivo-bevis för att lipidbaserade proteinlaster klassificeras till selektiva exportställen i den sekretoriska vägen, och avslöjar vikten av acylkedjelängd för klassificeringsselektivitet. Med hjälp av en kraftfull och banbrytande mikroskopiteknik som kallas SCLIM, demonstrerade vi den nyligen syntetiserade Gas1-GFP (en viktig plasmamembran-GPI-AP med en mycket lång acylkedje (C26) ceramidlipiddel) i jäst. Regionerna som är klustrade i diskreta ER är associerade med specifika ERES, medan transmembranutsöndrade proteiner är fördelade över hela ER-membranet (Figur 1). Dessutom går dessa två typer av gods selektivt in i olika ERES (Figur 2). Acylkedjelängden för den cellulära ceramiden i membranet reduceras från C26 till C18-C16, Gas1-GFP-klustret bryts ner till den diskreta ER-regionen, och Gas1-GFP omdirigeras för att lämna ER med transmembranproteinet genom samma ERES (Figur 3 och Figur 3).4).
Även om GPI-AP använder en specialiserad proteinmekanism för att lämna ER, fann vi att C26-ceramidberoende separation inte är beroende av differentiella proteininteraktioner som kan leda till ERES-specialisering (Figur S4 och S5). Istället stöder våra resultat en alternativ klassificeringsmekanism som drivs av lipidbaserad proteinklustring och efterföljande uteslutning av andra laster. Våra observationer indikerar att Gas1-GFP-regionen eller klustret associerat med ett specifikt ERES saknar det transmembranutsöndrade proteinet Mid2-iRFP, vilket indikerar att det C26-ceramidberoende GPI-AP-klustret kommer att underlätta deras inträde i relevant ERES, och samtidigt utesluta transmembran. Sekreten kommer in i detta specifika ERES (Figur 1 och 2). Däremot orsakar inte närvaron av C18-C16-ceramider i ER-membranet att GPI-AP bildar regioner eller kluster, så de utesluter eller ersätter inte transmembranutsöndrade proteiner i samma ERES (Figur 3 och 4). Därför föreslår vi att C26-ceramid driver separation och klassificering genom att underlätta klustring av proteiner kopplade till specifika ERES.
Hur uppnår man denna C26-ceramidberoende klusterbildning i ett specifikt ER-område? Membranceramidens tendens att separera lateralt kan orsaka att GPI-AP och C26-ceramid bildar små och omedelbart ordnade lipider i den mer oregelbundna lipidmiljön i ER-membranet som innehåller kortare och omättade glycerolipider. Kvalitetskluster (17, 18). Dessa små temporära kluster kan vidare fusioneras till större, mer stabila kluster efter bindning till p24-komplexet (34). I överensstämmelse med detta visade vi att C26 Gas1-GFP behöver interagera med p24-komplexet för att bilda större synliga kluster (Figur 3). P24-komplexet är en heterozygot oligomer bestående av fyra olika p24-transmembranproteiner i jäst (35), vilket ger multivalent bindning, vilket kan leda till tvärbindning av små GPI-AP-kluster, och därigenom generera större stabila kluster (34). Interaktionen mellan proteinektodomänerna i GPI-AP kan också bidra till deras aggregering, vilket visats under deras Golgi-transport i polariserade epitelceller från däggdjur (36). Men när C18-C16-ceramid finns i ER-membranet, kommer stora separata kluster inte att bildas när p24-komplexet binder till Gas1-GFP. Den underliggande mekanismen kan bero på de specifika fysikaliska och kemiska egenskaperna hos den långa acylkedjiga ceramiden. Biofysiska studier av artificiella membran visar att även om både långa (C24) och korta (C18-C16) acylkedjiga ceramider kan orsaka fasseparation, kan endast långa acylkedjiga ceramider (C24) främja hög krökning och filmböjning för att omforma filmen. Genom ömsesidig referens (17, 37, 38). Det har visats att transmembranhelixen hos TMED2, den mänskliga homologen till Emp24, selektivt interagerar med C18-ceramidbaserat sfingomyelin i de cytoplasmatiska lobulerna (39). Med hjälp av molekylärdynamik (MD)-simuleringar fann vi att både C18- och C26-ceramider ackumuleras runt de cytoplasmatiska lobulerna i Emp24-transmembranhelixen, och de har liknande preferenser (Figur S6). Det är värt att notera att detta indikerar att transmembranhelixen hos Emp24 kan leda till asymmetrisk distribution av lipider i membranet. Detta är ett färskt resultat baserat på däggdjursceller. Liknande MD-simuleringar visar också närvaron av eterlipider (40). Därför spekulerar vi att C26-ceramid i de två lobulerna i ER26 är lokalt anrikad. När GPI-AP i luminala lobuler binder direkt till multivalent p24 och ackumulering av C26-ceramid runt p24 i de cytoplasmatiska lobulerna, kan det främja den åtföljande proteinaggregeringen och membrankrökning som genereras genom fingrarna (41), vilket får GPI-AP att separera i diskreta regioner intill ERES, vilket också gynnar de starkt krökta regionerna i ER-membranet (42). Tidigare rapporter stödde den föreslagna mekanismen (43, 44). Den multivalenta bindningen av oligolektiner, patogener eller antikroppar till ceramidbaserade glykosfingolipider (GSL) på plasmamembranet utlöser stor GSL-aggregering, förbättrar fasseparationen och orsakar membrandeformation och internalisering (44). Iwabuchi etc. (43) Det visade sig att i närvaro av långa (C24) men inte korta (C16) acylkedjor inducerade den multivalenta liganden bunden till GSL-laktosylceramid bildandet av stora kluster och membraninvagination, och den cytoplasmatiska Lyn-medierade signaltransduktionen på sleevet är sammanflätad av acylkedjor i kopplade neutrofiler.
I däggdjurspolariserade epitelceller styr koncentrationen av anti-Golgi-nätverket (TGN) till nivån av det apikala plasmamembranet separationen och sorteringen av GPI-AP (10, 45). Denna aggregering drivs av GPI-AP-oligomerisering (36), men den kan också bero på ceramidkedjelängden vi hittar i jäst. Även om däggdjurs-GPI-AP har ett eterlipidbaserat ankare, och dess kemiska struktur skiljer sig mycket från den mycket långa acylkedjiga ceramiden, fann en nyligen genomförd studie att båda lipiderna har evolutionärt liknande fysikaliska och kemiska egenskaper och funktion (40). Därför kan eterlipiddelen i däggdjursceller likna C26-ceramiden i jäst, och dess roll är att associera med den långkedjiga ceramiden i membranet för att främja GPI-AP-aggregering och sortering. Även om denna möjlighet fortfarande behöver testas direkt, stöder tidigare fynd att transporten av den långa acylkedjiga ceramiden till Golgi-kroppen inte utförs av cytoplasmatiska överföringsproteiner, utan beror på syntesen av GPI-ankare som jäst. Därför verkar den evolutionärt konservativa mekanismen kunna selektivt samtransportera mycket långa acylkedjiga ceramider och GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) i samma transportvesikel.
I jäst- och däggdjurspolariserade epitelcellsystem sker GPI-AP-aggregering och separation från andra plasmamembranproteiner innan de når cellytan. Paladino et al. (48) fann att på TGN hos däggdjurspolariserade epitelceller är GPI-AP-klustring inte bara nödvändig för selektiv klassificering av GPI-AP till det apikala plasmamembranet, utan reglerar även klusterorganisationen av GPI-AP och dess biologiska aktivitet. Cellyta. I jäst visade denna studie att det C26-ceramidberoende GPI-AP-klustret på ER kan reglera klusterorganisationen och den funktionella aktiviteten hos GPI-AP på plasmamembranet (24, 49). I överensstämmelse med denna modell är GhLag1-celler allergiska mot GPI-hämmare eller läkemedel som påverkar cellväggens integritet (28), och behovet av funktionella Gas1-GFP-kluster (49) av den spetsceramid som projiceras i parningen av jästceller indikerar G​​​ Möjliga fysiologiska konsekvenser av hLag1-celler. GPI-AP-fel. Ytterligare tester av huruvida cellytans funktionella organisation har programmerats från ER genom en sorteringsmetod baserad på lipidlängd kommer dock att vara föremål för vår framtida forskning.
Saccharomyces cerevisiae-stammarna som användes i detta arbete listas i tabell S1. Stammarna MMY1583 och MMY1635 av SCLIM för levande cellavbildning konstruerades i bakgrunden av W303. Dessa stammar som uttrycker Sec13-mCherry med en fluorescerande proteinmärkning konstruerades med hjälp av en polymeraskedjereaktionsbaserad (PCR)-metod med pFA6a-plasmid som mall (23). Stammen som uttrycker Mid2-iRFP märkt med fluorescerande protein under kontroll av GAL1-promotorn konstruerades enligt följande. PCR-amplifiering av iRFP-KanMx-sekvens från pKTiRFP-KAN-vektor (gåva från E. O'Shea, Addgene-plasmidnummer 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; forskningsresursidentifierare (RRID): Addgene_64687) och insatt i C-terminalen av endogen Mid2. Efter att Mid2-iRFP-genomsekvensen amplifierats och klonats in i GAL1-promotorn integrerades den i Not I-Sac I-stället i integrationsplasmiden pRS306. Den resulterande plasmiden pRGS7 linjäriserades med Pst I för att integreras i URA3-lokuset.
Gas1-GFP-fusionsgenen uttrycks under kontroll av GAL1-promotorn i centromerplasmiden (CEN), vilken är konstruerad enligt följande. Gas1-GFP-sekvensen amplifierades med PCR från pRS416-GAS1-GFP-plasmiden (24) (gåva från L. Popolo) och klonades in i Xma I–Xho I-stället i CEN-plasmiden pBEVY-GL LEU2 (gåva från C). Miller; Addgene-plasmidnummer 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Den resulterande plasmiden fick namnet pRGS6. Axl2-GFP-fusionsgenen uttrycks också under kontroll av GAL1-promotorn i pBEVY-GL LEU2-vektorn, och dess konstruktion är enligt följande. Axl2-GFP-sekvensen amplifierades från pRS304-p2HSE-Axl2-GFP-plasmiden (23) med PCR och klonades in i BamHI-PstI-stället på pBEVY-GL LEU2-vektorn. Den resulterande plasmiden fick namnet pRGS12. Sekvensen för de oligonukleotider som användes i denna studie listas i tabell S2.
Stammen kompletterades med 0,2 % adenin och 2 % glukos [YP-dextros (YPD)], 2 % raffinos [YP-raffinos]-rikt jästextraktprotein p (YP)-medium (1 % jästextrakt och 2 % protein ept). (YPR)] eller 2 % galaktos [YP-galaktos (YPG)] som kolkälla, eller i ett syntetiskt minimalt medium (0,15 % jästkvävebas och 0,5 % ammoniumsulfat) för att komplettera lämpliga aminosyror och baser som krävs för näring, och innehållande 2 % glukos (syntetiskt glukosminimalmedium) eller 2 % galaktos (syntetiskt galaktosminimalmedium) som kolkälla.
För realtidsavbildning odlades temperaturkänsliga sec31-1-mutantceller som uttryckte konstruktionen under GAL1-promotorn i YPR-medium vid 24 °C över natten till mitten av logaritmisk fas. Efter induktion i YPG vid 24 °C i 1 timme inkuberades cellerna i SG vid 37 °C i 30 minuter och överfördes sedan till 24 °C för att frigöras från sekretionsblocket. Concanavalin A användes för att fixera cellerna på ett objektglas och avbildades med SCLIM. SCLIM är en kombination av Olympus IX-71 inverterat fluorescensmikroskop och UPlanSApo 100×1.4 numerisk aperturoljelins (Olympus), höghastighets- och högsignal-brusförhållande roterande skivkonfokalskanner (Yokogawa Electric), specialanpassad spektrometer och specialkylning. Systemets bildförstärkare (Hamamatsu Photonics) kan tillhandahålla ett förstoringssystem med en slutlig förstoring på ×266.7 och en laddningskopplad enhetskamera som multiplicerar elektroner (Hamamatsu Photonics) (21). Bildinsamling utförs med specialanpassad programvara (Yokogawa Electric). För 3D-bilder använde vi ett specialanpassat piezoelektriskt ställdon för att vibrera objektivlinsen vertikalt och samlade de optiska delarna 100 nm från varandra i en stapel. Z-stackbilden konverteras till 3D-voxeldata, och den teoretiska punktspridningsfunktionen som används för det roterande skivkonfokalmikroskopet används för dekonvolutionsbearbetning med Volocity-programvara (PerkinElmer). Genom att använda Volocity-programvara för att automatiskt tröskelvärdesberäkna för samlokaliseringsanalys mättes ERES inklusive last. Linjeskanningsanalys utfördes med hjälp av MetaMorph-programvara (Molecular Devices).
Använd GraphPad Prism-programvaran för att bestämma statistisk signifikans. För det tvåsidiga Student's t-testet och det vanliga envägsvariansanalystestet (ANOVA) anses skillnader mellan grupperna ha en signifikant inverkan på P <0,05 (*).
För fluorescensmikroskopi av Gas1-GFP odlades logaritmiska fasceller över natten i YPD och samlades in genom centrifugering, tvättades två gånger med fosfatbuffrad saltlösning och inkuberades på is i minst 15 minuter, och undersöktes sedan under mikroskop enligt tidigare beskrivning i kontroll (24). Leica DMi8-mikroskopet (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) utrustat med objektiv, L5 (GFP)-filter, Hamamatsu-kamera och Application Suite X (LAS X)-programvara användes för förvärv.
Proverna denaturerades med SDS-provbuffert vid 65 °C i 10 minuter och separerades sedan med SDS-polyakrylamidgelelektrofores (PAGE). För immunoblottinganalys laddades 10 μl prov per bana. Primär antikropp: Använd polyklonalt kanin-anti-Gas1 vid en utspädning av 1:3000, polyklonalt kanin-anti-Emp24 vid en utspädning av 1:500 och polyklonalt kanin-anti-GFP (en gåva från H. Riezman) vid en utspädning av 1:3000. Den monoklonala mus-anti-Pgk1-antikroppen användes vid en utspädning av 1:5000 (en gåva från J. de la Cruz). Sekundär antikropp: Pepparrotsperoxidas (HRP)-konjugerat get-anti-kanin-immunoglobulin G (IgG) användes vid en utspädning av 1:3000 (Pierce). HRP-konjugerad get-anti-mus-IgG användes i en utspädning av 1:3000 (Pierce). Immunsvarszonen observerades med kemiluminescensmetoden med SuperSignal West Pico-reagens (Thermo Fisher Scientific).
Som beskrivs i (31) utfördes ett experiment med naturlig immunoprecipitation på den anrikade ER-fraktionen. Kortfattat tvättades jästcellerna med TNE-buffert [50 mM tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid och proteashämmarblandning) vid 600 nm (OD600) vid 100 optisk densitet två gånger. Den krossades med glaspärlor, och sedan avlägsnades cellrester och glaspärlor genom centrifugering. Supernatanten centrifugerades sedan vid 17 000 g i 15 minuter vid 4 °C. Pelleten resuspenderades i TNE och digitalis-saponin tillsattes till en slutlig koncentration av 1 %. Suspensionen inkuberades i 1 timme under rotation vid 4 °C, och sedan avlägsnades de olösliga komponenterna genom centrifugering vid 13 000 g vid 4 °C i 60 minuter. För Gas1-GFP-immunoprecipitation, förinkubera först provet med tomma agaroskulor (ChromoTek) vid 4 °C i 1 timme och inkubera sedan med GFP-Trap_A (ChromoTek) vid 4 °C i 3 timmar. De immunoprecipiterade kulorna tvättades fem gånger med TNE innehållande 0,2 % digoxigenin, eluerades med SDS-provbuffert, separerades på SDS-PAGE och analyserades genom immunoblotting.
Som beskrivs i (31) utfördes tvärbindningsbestämning på den anrikade ER-fraktionen. Kortfattat inkuberades den anrikade ER-fraktionen med 0,5 mM ditiobis(succinimidylpropionat) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20 °C, 20 min). Tvärbindningsreaktionen avbröts genom tillsats av glycin (50 mM slutkoncentration, 5 minuter, 20 °C).
Som tidigare beskrivits (50) utfördes MS-analys av ceramid i vildtyps- och GhLag1-stammar. Kortfattat odlades cellerna till exponentiell fas (3 till 4 OD600-enheter/ml) i YPD vid 30°C, och 25×107 celler skördades. Deras metabolism släcktes med triklorättiksyra. Använd extraktionslösningsmedel [etanol, vatten, eter, pyridin och 4,2 N ammoniumhydroxid (15:15:5:1:0,018 v/v)] och 1,2 nmol intern standard C17 ceramid (860517, Avanti polär lipid) kvalitet). Använd monometylaminreagens [metanol, vatten, n-butanol och metylaminlösning (4:3:1:5 v/v)] för att utföra mild alkalisk hydrolys av extraktet, och använd sedan vattenmättad n-butanol för att avsalta. Slutligen resuspenderades extraktet i ett positivt lösningsmedel [kloroform/metanol/vatten (2:7:1) + 5 mM ammoniumacetat] och injicerades i masspektrometern. Multireaktionsövervakning (MRM) utfördes för identifiering och kvantifiering av sfingolipidmolekyler. TSQ Vantage tertiär kvadrupolmasspektrometer (Thermo Fisher Scientific) är utrustad med en robotiserad nanoflödesjonkälla Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) för lipidanalys. Kollisionsenergin är optimerad för varje ceramidkategori. MS-data erhölls i positivt läge. För varje biologiskt replikat är lipidsignalen medianen av tre oberoende mätningar.
Som beskrivs i (31) utsattes cellerna (800×107) som uttryckte Gas1-GFP för naturlig immunoprecipitation. Den renade Gas1-GFP separerades med SDS-PAGE och överfördes till ett polyvinylidenfluorid (PVDF)-membran. Proteinet visualiserades genom färgning av PVDF med amidsvart. Gas1-GFP-bandet klipptes från PVDF och tvättades 5 gånger med metanol och en gång med vatten av vätskekromatografi-MS (LC-MS)-kvalitet. Genom att inkubera membranremsan med 500 μl 0,3 M NaOAc (pH 4,0), buffert och 500 μl färskt upplöst 1 M natriumnitritblandning vid 37 °C i 3 timmar frigörs lipidfraktionen från Gas1-GFP och lyseras. Frisättning av inosinfosfatceramid mellan glukosamin och inositol (51). Därefter tvättades membranremsan fyra gånger med vatten av LC-MS-kvalitet, torkades vid rumstemperatur och förvarades i kvävgasatmosfär vid -80 °C fram till analys. Som kontroll användes ett blankprov av PVDF-membran för varje experiment. Lipiden extraherad från Gas1-GFP analyserades sedan med MS enligt beskrivning (50). Kortfattat resuspenderades PVDF-remsor innehållande GPI-lipid i 75 μl negativt mögellösningsmedel [kloroform/metanol (1:2) + 5 mM ammoniumacetat] och genomgick elektrosprayjonisering (ESI)-MRM/MS-analys av sfingolipidarter (TSQ Vantage). I detta fall erhölls MS-data i negativ jonläge.
Som tidigare nämnts separerades lipiddelen av GPI-ankaret från den [3H]-inositol-märkta GPI-AP (16). Lipiderna separerades genom tunnskiktskromatografi med användning av ett lösningsmedelssystem (55:45:10 kloroform-metanol-0,25 % KCl) och visualiserades med FLA-7000 (Fujifilm).
Cellerna som uttryckte Gas1-GFP (600×107) tvättades två gånger med TNE-buffert, krossades med glaspärlor och centrifugerades sedan för att avlägsna cellrester och glaspärlor. Supernatanten centrifugerades sedan vid 17 000 g i 1 timme vid 4 °C. Pelleten tvättades i TNE och inkuberades med 1 U PI-PLC (Invitrogen) i TNE innehållande 0,2 % digitalis-saponin i 1 timme vid 37 °C. Efter enzymbehandlingen avlägsnades membranet genom centrifugering vid 17 000 g vid 4 °C i 1 timme. För att immunoprecipitera Gas1-GFP inkuberades supernatanten med GFP-Trap_A (ChromoTek) vid 4 °C över natten. Den renade Gas1-GFP som separerats med SDS-PAGE färgades med Coomassie briljantblått. Gas1-GFP-färgningsbandet skars av från det gråa området runt akvedukten, och efter alkylering med jodacetamid och reduktion med ditiotreitol utfördes in-gel-digerering med trypsin. Extrahera och torka tryptiska peptider och peptider med GPI-glykaner. Den torkade peptiden löstes i 20 μl vatten. Injicera en portion (8μl) i LC. En oktadecylsilan (ODS)-kolonn (Develosil 300ODS-HG-5; innerdiameter 150 mm × 1,0 mm; Nomura Chemical, Aichi Prefecture, Japan) användes för att separera peptider under specifika gradientförhållanden. Den mobila fasen är lösningsmedel A (0,08 % myrsyra) och lösningsmedel B (0,15 % myrsyra i 80 % acetonitril). Ett Accela HPLC-system (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) användes för att eluera kolonnen med lösningsmedel A inom 55 minuter vid en flödeshastighet av 50 μl min-1 i 5 minuter, och sedan ökades koncentrationen av lösningsmedel B till 40 %. (USA). Eluatet introducerades kontinuerligt i ESI-jonkällan, och de tryptiska peptiderna och peptiderna med GPI-glykaner analyserades med LTQ Orbitrap XL (hybrid linjär jonfälla-orbitrap-masspektrometer; Thermo Fisher Scientific). I MS-uppsättningen inställdes kapillärkällans spänning på 4,5 kV och temperaturen på överföringskapillären hölls vid 300 °C. Kapillärspänningen och rörlinsspänningen inställdes på 15 V respektive 50 V. MS-data erhölls i positiv jonläge (upplösning på 60 000; massnoggrannhet på 10 miljondelar) i ett massområde på 300/m/z mass/laddningsförhållande (m/z) 3000. MS/MS-data erhålls genom jonfällan i LTQ Orbitrap XL [de första 3 siffrorna som data beror på, kollisionsinducerad dissociation (CID)].
MD-simuleringar utfördes med GROMACS (52) programvara och MARTINI 2 kraftfält (53-55). CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) användes sedan för att konstruera ett dubbelskikt innehållande dioleoylfosfatidylkolin (DOPC) och Cer C18 eller DOPC och Cer C26. Topologin och koordinaterna för Cer C26 härleds från DXCE genom att ta bort de extra kulorna från sfingosinsvansen. Använd processen som beskrivs nedan för att balansera dubbelskiktet och kör det, använd sedan systemets sista koordinater för att bygga ett system innehållande Emp24. Transmembrandomänen hos jäst Emp24 (resterna 173 till 193) konstruerades som en α-helix med hjälp av det visuella MD (VMD) verktyget för molekylstruktur (58). Sedan, efter att de överlappande lipiderna tagits bort, granulerades proteinet grovt och insattes i dubbelskiktet med hjälp av CHARMM GUI. Det slutliga systemet innehåller 1202 DOPC och 302 Cer C26 eller 1197 DOPC och 295 Cer C18 och Emp24. Jonisera systemet till en koncentration av 0,150 M. Fyra oberoende replikat gjordes för två dubbelskiktskompositioner.
Lipiddubbelskiktet balanseras med hjälp av CHARMM GUI-processen, vilket innebär att 405 000 steg minimeras och sedan balanseras, där positionsbegränsningarna gradvis minskas och elimineras, och tidssteget ökas från 0,005 ps till 0,02 ps. Efter ekvilibrering produceras 6 µs med ett tidssteg på 0,02 ps. Efter att Emp24 har satts in, använd samma CHARMM GUI-process för att minimera och balansera systemet, och kör sedan i 8 sekunder i produktion.
För alla system styrs trycket under balanseringsprocessen av Berendsen-barostaten (59), och under produktionsprocessen av Parrinello-Rahman-barostaten (60). I samtliga fall är medeltrycket 1 bar och ett semi-isotropiskt tryckkopplingsschema används. I balanserings- och produktionsprocessen används en termostat (61) med hastighetsomkalibrering för att koppla temperaturen hos protein-, lipid- respektive lösningsmedelspartiklar. Under hela operationen är måltemperaturen 310 K. Den icke-bindande interaktionen beräknas genom att generera en parningslista med hjälp av Verlet-schemat med 0,005 bufferttolerans. Coulomb-termen beräknas med hjälp av reaktionsfältet och ett gränsavstånd på 1,1 nm. Vander Waals-termen använder ett gränsavstånd med ett gränsavstånd på 1,1 nm, och Verlet-gränsavståndet används för potentiell drift (62).
Med hjälp av VMD är gränsvåglängden mellan DOPC-fosfatkulor eller ceramid AM1-kulor och proteinet 0,7 nm, och antalet lipider som interagerar med proteinet beräknas. Beräkna utarmnings-anrikningsfaktorn (DE) enligt följande formel som i (63): DE-faktor = (mängden totala lipider i proteinet 0,7) i proteinet 0,7 (mängden Cer i totala lipider)
Det rapporterade värdet erhålls som ett medelvärde, och felstaplarna är fyra oberoende kopior av SE. Den statistiska signifikansen av DE-faktorn beräknas med t-test [(medelvärdeDE-faktor-1)/SE]. Beräkna p-värdet från den ensidiga fördelningen.
GROMACS-verktyget användes för att beräkna den 2D-laterala densitetskartan för systemet som innehåller Emp24 inom de sista 250 ns av spåret. För att erhålla anriknings-/utarmningskartan för ceramid divideras densitetskartan för Cer med summan av kartan för Cer och DOPC, och sedan divideras med koncentrationen av Cer i kroppen. Samma färgkartskala används.
För kompletterande material till den här artikeln, se http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Detta är en artikel med öppen åtkomst som distribueras under villkoren i Creative Commons Attribution-Non-Commercial-licensen, som tillåter användning, distribution och reproduktion i vilket medium som helst, så länge den slutliga användningen inte är för kommersiell vinning och förutsättningen är att originalverket är korrekt. Referens.
Obs: Vi ber dig bara att ange din e-postadress så att personen du rekommenderar till sidan vet att du vill att de ska se e-postmeddelandet och att det inte är skräppost. Vi kommer inte att samla in några e-postadresser.
Den här frågan används för att testa om du är en besökare och förhindra automatisk spam.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero (Serez-Linero), Mier Sergio L L Wagho, Wagho (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D-högupplöst realtidsavbildning avslöjar vikten av ceramidkedjelängd för proteinsortering i selektiva utgångsställen.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero (Serez-Linero), Mier Sergio L L Wagho, Wagho (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D-högupplöst realtidsavbildning avslöjar vikten av ceramidkedjelängd för proteinsortering i selektiva utgångsställen.
©2020 American Association for the Advancement of Science. alla rättigheter reserverade. AAAS är partner till HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef och COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.