Tack för att du besöker nature.com. Webbläsarversionen du använder har begränsat CSS-stöd. För bästa upplevelse rekommenderar vi att du använder den senaste webbläsarversionen (eller att du stänger av kompatibilitetsläget i Internet Explorer). För att säkerställa fortsatt stöd kommer den här webbplatsen dessutom inte att innehålla stilar eller JavaScript.
Vätesulfid (H2S) har flera fysiologiska och patologiska effekter på människokroppen. Natriumhydrosulfid (NaHS) används ofta som ett farmakologiskt verktyg för att utvärdera effekterna av H2S i biologiska experiment. Även om förlusten av H2S från NaHS-lösningar bara tar några minuter, har NaHS-lösningar använts som donatorföreningar för H2S i dricksvatten i vissa djurstudier. Denna studie undersökte om dricksvatten med en NaHS-koncentration på 30 μM berett i rått-/musflaskor kunde förbli stabilt i minst 12–24 timmar, vilket föreslagits av vissa författare. Bered en lösning av NaHS (30 μM) i dricksvatten och häll den omedelbart i rått-/musvattenflaskor. Prover samlades in från spetsen och insidan av vattenflaskan vid 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 och 24 timmar för att mäta sulfidhalten med hjälp av metylenblåttmetoden. Dessutom injicerades han- och honråttor med NaHS (30 μM) i två veckor och serumsulfidkoncentrationerna mättes varannan dag under den första veckan och i slutet av den andra veckan. NaHS-lösningen i provet som erhölls från spetsen på vattenflaskan var instabil; den minskade med 72 % respektive 75 % efter 12 respektive 24 timmar. I prover som erhölls från insidan av vattenflaskorna var minskningen av NaHS inte signifikant inom 2 timmar; den minskade dock med 47 % respektive 72 % efter 12 respektive 24 timmar. NaHS-injektion påverkade inte serumsulfidnivån hos han- och honråttor. Sammanfattningsvis bör NaHS-lösningar framställda från dricksvatten inte användas för H2S-donation eftersom lösningen är instabil. Denna administreringsväg kommer att utsätta djuren för oregelbundna och mindre mängder NaHS än förväntat.
Vätesulfid (H2S) har använts som ett toxin sedan 1700; dess möjliga roll som en endogen biosignalmolekyl beskrevs dock av Abe och Kimura 1996. Under de senaste tre decennierna har ett flertal funktioner hos H2S i olika mänskliga system klarlagts, vilket lett till insikten att H2S-donatormolekyler kan ha kliniska tillämpningar vid behandling eller hantering av vissa sjukdomar; se Chirino et al. för en nyligen genomförd översikt.
Natriumhydrosulfid (NaHS) har använts i stor utsträckning som ett farmakologiskt verktyg för att bedöma effekterna av H2S i många cellkultur- och djurstudier5,6,7,8. NaHS är dock inte en idealisk H2S-donator eftersom det snabbt omvandlas till H2S/HS- i lösning, lätt kontamineras med polysulfider och lätt oxideras och förångas4,9. I många biologiska experiment löses NaHS i vatten, vilket resulterar i passiv förångning och förlust av H2S10,11,12, spontan oxidation av H2S11,12,13 och fotolys14. Sulfid i den ursprungliga lösningen förloras mycket snabbt på grund av förångning av H2S11. I en öppen behållare är halveringstiden (t1/2) för H2S cirka 5 minuter och dess koncentration minskar med cirka 13 % per minut10. Även om förlusten av vätesulfid från NaHS-lösningar bara tar några minuter, har vissa djurstudier använt NaHS-lösningar som en källa till vätesulfid i dricksvatten i 1–21 veckor, och ersatt den NaHS-innehållande lösningen var 12–24:e timme.15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 Denna praxis är inte förenlig med principerna för vetenskaplig forskning, eftersom läkemedelsdoser bör baseras på deras användning i andra arter, särskilt människor.27
Preklinisk forskning inom biomedicin syftar till att förbättra kvaliteten på patientvården eller behandlingsresultaten. Resultaten från de flesta djurstudier har dock ännu inte översatts till människor28,29,30. En av anledningarna till detta translationella misslyckande är bristen på uppmärksamhet på den metodologiska kvaliteten i djurstudier30. Syftet med denna studie var därför att undersöka om 30 μM NaHS-lösningar beredda i rått-/musvattenflaskor kunde förbli stabila i dricksvatten i 12–24 timmar, vilket hävdats eller föreslagits i vissa studier.
Alla experiment i denna studie utfördes i enlighet med de publicerade riktlinjerna för skötsel och användning av försöksdjur i Iran31. Alla experimentella rapporter i denna studie följde också ARRIVE-riktlinjerna32. Etikkommittén vid Institutet för endokrina vetenskaper, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, godkände alla experimentella procedurer i denna studie.
Zinkacetatdihydrat (CAS: 5970-45-6) och vattenfri järnklorid (CAS: 7705-08-0) köptes från Biochem, Chemopahrama (Cosne-sur-Loire, Frankrike). Natriumhydrosulfidhydrat (CAS: 207683-19-0) och N,N-dimetyl-p-fenylendiamin (DMPD) (CAS: 535-47-0) köptes från Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Isofluran köptes från Piramal (Bethlehem, PA, USA). Saltsyra (HCl) köptes från Merck (Darmstadt, Tyskland).
Bered en lösning av NaHS (30 μM) i dricksvatten och häll den omedelbart i rått-/musvattenflaskorna. Denna koncentration valdes baserat på ett flertal publikationer som använder NaHS som källa till H2S; se diskussionsavsnittet. NaHS är en hydratiserad molekyl som kan innehålla varierande mängder hydratvatten (dvs. NaHS•xH2O); enligt tillverkaren var andelen NaHS som användes i vår studie 70,7 % (dvs. NaHS•1,3 H2O), och vi tog hänsyn till detta värde i våra beräkningar, där vi använde en molekylvikt på 56,06 g/mol, vilket är molekylvikten för vattenfri NaHS. Hydratvatten (även kallat kristallisationsvatten) är de vattenmolekyler som utgör den kristallina strukturen33. Hydrater har andra fysikaliska och termodynamiska egenskaper jämfört med anhydrater34.
Innan NaHS tillsätts till dricksvattnet, mät lösningsmedlets pH och temperatur. Häll omedelbart NaHS-lösningen i rått-/musvattenflaskan i djurburen. Prover samlades in från spetsen och från insidan av vattenflaskan vid 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 och 24 timmar för att mäta sulfidinnehållet. Sulfidmätningar togs omedelbart efter varje provtagning. Vi tog prover från spetsen på röret eftersom vissa studier har visat att vattenrörets lilla porstorlek kan minimera H2S-avdunstning15,19. Detta problem verkar gälla även lösningen i flaskan. Detta var dock inte fallet för lösningen i vattenflaskans hals, som hade en högre avdunstningshastighet och var autooxiderande; djuren drack faktiskt detta vatten först.
Han- och honråttor av typen Wistar användes i studien. Råttorna hölls i polypropenburar (2–3 råttor per bur) under standardförhållanden (temperatur 21–26 °C, luftfuktighet 32–40 %) med 12 timmars ljus (kl. 07.00 till 19.00) och 12 timmars mörker (kl. 19.00 till 07.00). Råttorna hade fri tillgång till kranvatten och utfodrades med standardfoder (Khorak Dam Pars Company, Teheran, Iran). Åldersmatchade (6 månader) honråttor (n=10, kroppsvikt: 190–230 g) och hanråttor (n=10, kroppsvikt: 320–370 g) av typen Wistar delades slumpmässigt in i kontrollgrupper och grupper behandlade med NaHS (30 μM) (n=5 per grupp). För att bestämma urvalsstorleken använde vi KISS-metoden (Keep It Simple, Stupid), som kombinerar tidigare erfarenhet och styrkeanalys35. Vi genomförde först en pilotstudie på 3 råttor och bestämde den genomsnittliga totala sulfidnivån i serum och standardavvikelsen (8,1 ± 0,81 μM). Sedan, med 80 % effekt och en tvåsidig signifikansnivå på 5 %, bestämde vi en preliminär urvalsstorlek (n = 5 baserat på tidigare litteratur) som motsvarade en standardiserad effektstorlek på 2,02 med det fördefinierade värdet som föreslagits av Festing för att beräkna urvalsstorleken för försöksdjur35. Efter att ha multiplicerat detta värde med SD (2,02 × 0,81) var den förutspådda detekterbara effektstorleken (1,6 μM) 20 %, vilket är acceptabelt. Detta innebär att n = 5/grupp är tillräckligt för att detektera en genomsnittlig förändring på 20 % mellan grupperna. Råttorna delades slumpmässigt in i kontroll- och NaSH-behandlade grupper med hjälp av slumpfunktionen i Excel-programvaran36 (kompletterande figur 1). Blindning utfördes på utfallsnivå, och forskarna som utförde de biokemiska mätningarna var inte medvetna om grupptilldelningarna.
NaHS-grupperna av båda könen behandlades med 30 μM NaHS-lösning beredd i dricksvatten i 2 veckor; färsk lösning tillfördes var 24:e timme, under vilken tid kroppsvikten mättes. Blodprover samlades in från svansspetsarna på alla råttor under isoflurananestesi varannan dag i slutet av den första och andra veckan. Blodproverna centrifugerades vid 3000 g i 10 minuter, serum separerades och förvarades vid –80 °C för efterföljande mätning av serumurea, kreatinin (Cr) och total sulfid. Serumurea bestämdes med enzymatisk ureasmetod och serumkreatinin bestämdes med fotometrisk Jaffe-metod med kommersiellt tillgängliga kit (Man Company, Teheran, Iran) och en automatisk analysator (Selectra E, serienummer 0-2124, Nederländerna). Intra- och interassay-variationskoefficienterna för urea och Cr var mindre än 2,5 %.
Metylenblåttmetoden (MB) används för att mäta total sulfid i dricksvatten och serum som innehåller NaHS; MB är den vanligaste metoden för att mäta sulfid i bulklösningar och biologiska prover11,37. MB-metoden kan användas för att uppskatta den totala sulfidpoolen38 och mäta oorganiska sulfider i form av H2S, HS- och S2 i vattenfasen39. I denna metod utfälls svavel som zinksulfid (ZnS) i närvaro av zinkacetat11,38. Utfällning med zinkacetat är den mest använda metoden för att separera sulfider från andra kromoforer11. ZnS återupplöstes med HCl11 under starkt sura förhållanden. Sulfiden reagerar med DMPD i ett stökiometriskt förhållande på 1:2 i en reaktion katalyserad av järnklorid (Fe3+ fungerar som ett oxidationsmedel) för att bilda färgämnet MB, vilket detekteras spektrofotometriskt vid 670 nm40,41. Detektionsgränsen för MB-metoden är ungefär 1 μM11.
I denna studie tillsattes 100 μL av varje prov (lösning eller serum) till ett rör; sedan tillsattes 200 μL zinkacetat (1 % w/v i destillerat vatten), 100 μL DMPD (20 mM i 7,2 M HCl) och 133 μL FeCl3 (30 mM i 1,2 M HCl). Blandningen inkuberades vid 37 °C i mörker i 30 minuter. Lösningen centrifugerades vid 10 000 g i 10 minuter, och supernatantens absorbans avlästes vid 670 nm med hjälp av en mikroplattläsare (BioTek, MQX2000R2, Winooski, VT, USA). Sulfidkoncentrationerna bestämdes med hjälp av en kalibreringskurva för NaHS (0–100 μM) i ddH2O (kompletterande figur 2). Alla lösningar som användes för mätningarna var färskframställda. Intra- och interassay-variationskoefficienterna för sulfidmätningar var 2,8 % respektive 3,4 %. Vi bestämde också den totala sulfidmängden som utvanns från natriumtiosulfatinnehållande dricksvatten- och serumprover med hjälp av den berikade provmetoden42. Utbytet för natriumtiosulfatinnehållande dricksvatten- och serumprover var 91 ± 1,1 % (n = 6) respektive 93 ± 2,4 % (n = 6).
Statistisk analys utfördes med GraphPad Prism-programvara version 8.0.2 för Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA, www.graphpad.com). Ett parat t-test användes för att jämföra temperatur och pH i dricksvatten före och efter tillsats av NaHS. Förlusten av H2S i den NaHS-innehållande lösningen beräknades som en procentuell minskning från baslinjeupptaget, och för att bedöma om förlusten var statistiskt signifikant utförde vi en envägs upprepade-mätnings-ANOVA följt av Dunnetts multipla jämförelsetest. Kroppsvikt, serumurea, serumkreatinin och total serumsulfid över tid jämfördes mellan kontroll- och NaHS-behandlade råttor av olika kön med hjälp av en tvåvägs blandad (mellan-inom) ANOVA följt av ett Bonferroni post hoc-test. Tvåsidiga P-värden < 0,05 ansågs statistiskt signifikanta.
Dricksvattnets pH var 7,60 ± 0,01 före tillsats av NaHS och 7,71 ± 0,03 efter tillsats av NaHS (n = 13, p = 0,0029). Dricksvattnets temperatur var 26,5 ± 0,2 och minskade till 26,2 ± 0,2 efter tillsats av NaHS (n = 13, p = 0,0128). Bered 30 μM NaHS-lösning i dricksvatten och förvara den i en vattenflaska. NaHS-lösningen är instabil och dess koncentration minskar med tiden. Vid provtagning från vattenflaskans hals observerades en signifikant minskning (68,0 %) inom den första timmen, och NaHS-halten i lösningen minskade med 72 % respektive 75 % efter 12 respektive 24 timmar. I prover erhållna från vattenflaskor var minskningen av NaHS inte signifikant upp till 2 timmar, men efter 12 respektive 24 timmar hade den minskat med 47 % respektive 72 %. Dessa data indikerar att andelen NaHS i en 30 μM lösning beredd i dricksvatten hade minskat till ungefär en fjärdedel av initialvärdet efter 24 timmar, oavsett provtagningsplats (Figur 1).
Stabilitet hos NaHS-lösning (30 μM) i dricksvatten i rått-/musflaskor. Efter lösningsberedning togs prover från spetsen och vattenflaskans insida. Data presenteras som medelvärde ± SD (n = 6/grupp). * och #, P < 0,05 jämfört med tid 0. Fotografiet av vattenflaskan visar spetsen (med öppning) och flaskans kropp. Spetsvolymen är cirka 740 μL.
Koncentrationen av NaHS i den nyberedda 30 μM-lösningen var 30,3 ± 0,4 μM (intervall: 28,7–31,9 μM, n = 12). Efter 24 timmar minskade dock koncentrationen av NaHS till ett lägre värde (medelvärde: 3,0 ± 0,6 μM). Som visas i figur 2 var koncentrationerna av NaHS som råttorna exponerades för inte konstanta under studieperioden.
Kroppsvikten hos honråttor ökade signifikant över tid (från 205,2 ± 5,2 g till 213,8 ​​± 7,0 g i kontrollgruppen och från 204,0 ± 8,6 g till 211,8 ± 7,5 g i den NaHS-behandlade gruppen); NaHS-behandling hade dock ingen effekt på kroppsvikten (Fig. 3). Kroppsvikten hos hanråttor ökade signifikant över tid (från 338,6 ± 8,3 g till 352,4 ± 6,0 g i kontrollgruppen och från 352,4 ± 5,9 g till 363,2 ± 4,3 g i den NaHS-behandlade gruppen); NaHS-behandling hade dock ingen effekt på kroppsvikten (Fig. 3).
Förändringar i kroppsvikt hos hon- och hanråttor efter administrering av NaHS (30 μM). Data presenteras som medelvärde ± SEM och jämfördes med tvåvägs blandad (inom-mellan) variansanalys med Bonferroni post hoc-test. n = 5 av varje kön i varje grupp.
Serumurea- och kreatinfosfatkoncentrationerna var jämförbara hos kontrollråttor och NaSH-behandlade råttor under hela studien. Dessutom påverkade inte NaSH-behandling serumurea- och kreatinkromkoncentrationerna (tabell 1).
Baslinjekoncentrationerna av total sulfid i serum var jämförbara mellan kontrollgruppen och NaHS-behandlade hanråttor (8,1 ± 0,5 μM vs. 9,3 ± 0,2 μM) och honråttor (9,1 ± 1,0 μM vs. 6,1 ± 1,1 μM). NaHS-administrering i 14 dagar hade ingen effekt på totala sulfidnivåer i serum hos vare sig han- eller honråttor (Fig. 4).
Förändringar i serumkoncentrationer av total sulfid hos han- och honråttor efter administrering av NaHS (30 μM). Data presenteras som medelvärde ± SEM och jämfördes med en tvåvägs blandad (inom-inom) variansanalys med Bonferroni post hoc-test. Varje kön, n = 5/grupp.
Den huvudsakliga slutsatsen av denna studie är att dricksvatten som innehåller NaHS är instabilt: endast ungefär en fjärdedel av det initiala totala sulfidinnehållet kan detekteras 24 timmar efter provtagning från spetsen och inuti rått-/musvattenflaskor. Dessutom exponerades råttor för instabila NaHS-koncentrationer på grund av förlusten av H2S i NaHS-lösningen, och tillsatsen av NaHS till dricksvatten påverkade inte kroppsvikt, serumurea och kreatinkrom, eller total serumsulfid.
I denna studie var H2S-förlusten från 30 μM NaHS-lösningar beredda i dricksvatten cirka 3 % per timme. I en buffrad lösning (100 μM natriumsulfid i 10 mM PBS, pH 7,4) rapporterades sulfidkoncentrationen minska med 7 % över tid under 8 timmar. Vi har tidigare försvarat intraperitoneal administrering av NaHS genom att rapportera att sulfidförlusten från en 54 μM NaHS-lösning i dricksvatten var cirka 2,3 % per timme (4 %/timme under de första 12 timmarna och 1,4 %/timme under de sista 12 timmarna efter beredning)8. Tidigare studier43 fann en konstant förlust av H2S från NaHS-lösningar, främst på grund av förångning och oxidation. Även utan tillsats av bubblor förloras sulfid i stamlösningen snabbt på grund av H2S-förångning11. Studier har visat att under utspädningsprocessen, som tar cirka 30–60 sekunder, förloras cirka 5–10 % av H2S på grund av avdunstning6. För att förhindra avdunstning av H2S från lösningen har forskare vidtagit flera åtgärder, inklusive försiktig omrörning av lösningen12, täckning av stamlösningen med plastfilm6 och minimerad exponering av lösningen för luft, eftersom hastigheten för H2S-avdunstningen beror på gränssnittet mellan luft och vätska.13 Spontan oxidation av H2S sker huvudsakligen på grund av övergångsmetalljoner, särskilt järn(III)-joner, vilka är föroreningar i vatten.13 Oxidation av H2S resulterar i bildandet av polysulfider (svavelatomer sammanlänkade med kovalenta bindningar)11. För att undvika dess oxidation framställs lösningar innehållande H2S i deoxygenerade lösningsmedel44,45 och spolas sedan med argon eller kväve i 20–30 minuter för att säkerställa deoxygenering.11,12,37,44,45,46 Dietylentriaminpentaättiksyra (DTPA) är en metallkelator (10–4 M) som förhindrar HS-autooxidation i aeroba lösningar. I frånvaro av DTPA är autooxidationshastigheten för HS- cirka 50 % under cirka 3 timmar vid 25 °C37,47. Eftersom oxidationen av 1e-sulfid katalyseras av ultraviolett ljus bör lösningen dessutom förvaras på is och skyddas från ljus11.
Som visas i figur 5 dissocierar NaHS till Na+ och HS-6 när det löses i vatten; denna dissociation bestäms av reaktionens pK1, vilket är temperaturberoende: pK1 = 3,122 + 1132/T, där T varierar från 5 till 30°C och mäts i grader Kelvin (K), K = °C + 273,1548. HS- har ett högt pK2 (pK2 = 19), så vid pH < 96,49 bildas inte S2- eller bildas i mycket små mängder. Däremot fungerar HS- som en bas och tar emot H+ från en H2O-molekyl, och H2O fungerar som en syra och omvandlas till H2S och OH-.
Bildning av löst H2S-gas i NaHS-lösning (30 µM). aq, vattenlösning; g, gas; l, vätska. Alla beräkningar förutsätter att vattnets pH = 7,0 och vattentemperaturen = 20 °C. Skapad med BioRender.com.
Trots bevis för att NaHS-lösningar är instabila har flera djurstudier använt NaHS-lösningar i dricksvatten som en H2S-donatorförening15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 med interventionstider från 1 till 21 veckor (tabell 2). Under dessa studier förnyades NaHS-lösningen var 12:e, 15:e, 17:e, 18:e, 24:e, 25:e eller 24:e, 19:e, 20:e, 21:e, 22:e, 23:e timme. Våra resultat visade att råttor exponerades för instabila läkemedelskoncentrationer på grund av förlusten av H2S från NaHS-lösningen, och NaHS-halten i råttornas dricksvatten fluktuerade signifikant under 12 eller 24 timmar (se figur 2). Två av dessa studier rapporterade att H2S-nivåerna i vatten förblev stabila under 24 timmar22 eller att endast 2–3 % H2S-förluster observerades under 12 timmar15, men de tillhandahöll inga stödjande data eller mätdetaljer. Två studier har visat att vattenflaskors lilla diameter kan minimera H2S-avdunstning15,19. Våra resultat visade dock att detta bara kan fördröja H2S-förlusten från en vattenflaska med 2 timmar snarare än 12–24 timmar. Båda studierna noterar att vi antar att NaHS-nivån i dricksvattnet inte förändrades eftersom vi inte observerade någon färgförändring i vattnet; därför var oxidationen av H2S med luft inte signifikant19,20. Överraskande nog bedömer denna subjektiva metod stabiliteten hos NaHS i vatten snarare än att mäta förändringen i dess koncentration över tid.
Förlusten av H2S i NaHS-lösning är relaterad till pH och temperatur. Som noterats i vår studie resulterar upplösning av NaHS i vatten i bildandet av en alkalisk lösning50. När NaHS löses i vatten beror bildandet av upplöst H2S-gas på pH-värdet6. Ju lägre lösningens pH är, desto större andel NaHS finns som H2S-gasmolekyler och desto mer sulfid förloras från vattenlösningen11. Ingen av dessa studier rapporterade pH-värdet för dricksvatten som används som lösningsmedel för NaHS. Enligt WHO:s rekommendationer, som antas av de flesta länder, bör pH-värdet för dricksvatten ligga i intervallet 6,5–8,551. I detta pH-intervall ökar hastigheten för spontan oxidation av H2S ungefär tiofaldigt13. Upplösning av NaHS i vatten i detta pH-intervall kommer att resultera i en koncentration av upplöst H2S-gas på 1 till 22,5 μM, vilket betonar vikten av att övervaka vattnets pH innan NaHS löses upp. Dessutom skulle temperaturintervallet som rapporterats i ovanstående studie (18–26 °C) resultera i en förändring av koncentrationen av löst H2S-gas i lösningen på cirka 10 %, eftersom temperaturförändringar förändrar pK1, och små förändringar i pK1 kan ha en betydande inverkan på koncentrationen av löst H2S-gas48. Dessutom förvärrar den långa varaktigheten av vissa studier (5 månader)22, under vilka stora temperaturvariationer förväntas, också detta problem.
Alla studier utom en21 använde 30 μM NaHS-lösning i dricksvatten. För att förklara den använda dosen (dvs. 30 μM) påpekade vissa författare att NaHS i vattenfasen producerar exakt samma koncentration av H2S-gas och att det fysiologiska intervallet för H2S är 10 till 100 μM, så denna dos ligger inom det fysiologiska intervallet15,16. Andra förklarade att 30 μM NaHS kan bibehålla plasmanivån av H2S inom det fysiologiska intervallet, dvs. 5–300 μM19,20. Vi betraktar koncentrationen av NaHS i vatten på 30 μM (pH = 7,0, Tm = 20 °C), vilket användes i vissa studier för att studera effekterna av H2S. Vi kan beräkna att koncentrationen av upplöst H2S-gas är 14,7 μM, vilket är cirka 50 % av den initiala NaHS-koncentrationen. Detta värde liknar det värde som beräknats av andra författare under samma förhållanden13,48.
I vår studie förändrade inte NaHS-administrering kroppsvikten; detta resultat överensstämmer med resultaten från andra studier på hanmöss22,23 och hanråttor18; Två studier rapporterade dock att NaSH återställde den minskade kroppsvikten hos nefrektomiserade råttor24,26, medan andra studier inte rapporterade effekten av NaSH-administrering på kroppsvikt15,16,17,19,20,21,25. Dessutom påverkade inte NaSH-administrering serumurea- och kreatinkromnivåerna i vår studie, vilket överensstämmer med resultaten från en annan rapport25.
Studien fann att tillsats av NaHS till dricksvatten i 2 veckor inte påverkade den totala serumsulfidkoncentrationen hos han- och honråttor. Detta fynd överensstämmer med resultaten från Sen et al. (16): 8 veckors behandling med 30 μM NaHS i dricksvatten påverkade inte plasmasulfidnivåerna hos kontrollråttor; de rapporterade dock att denna intervention återställde de minskade H2S-nivåerna i plasma hos nefrektomiserade möss. Li et al. (22) rapporterade också att behandling med 30 μM NaHS i dricksvatten i 5 månader ökade plasmanivåerna av fri sulfid hos åldrade möss med cirka 26 %. Andra studier har inte rapporterat förändringar i cirkulerande sulfid efter tillsats av NaHS till dricksvatten.
Sju studier rapporterade användning av Sigma NaHS15,16,19,20,21,22,23 men gav inte ytterligare detaljer om hydratiseringsvattnet, och fem studier nämnde inte källan till NaHS som användes i deras framställningsmetoder17,18,24,25,26. NaHS är en hydratiserad molekyl och dess hydratiseringsvatteninnehåll kan variera, vilket påverkar mängden NaHS som krävs för att framställa en lösning med en given molaritet. Till exempel var NaHS-innehållet i vår studie NaHS•1,3 H2O. Således kan de faktiska NaHS-koncentrationerna i dessa studier vara lägre än de som rapporterats.
”Hur kan en så kortlivad förening ha en så långvarig effekt?” Pozgay et al.21 ställde denna fråga när de utvärderade effekterna av NaHS på kolit hos möss. De hoppas att framtida studier kommer att kunna besvara denna fråga och spekulera i att NaHS-lösningar kan innehålla mer stabila polysulfider utöver H2S och disulfider som medierar effekten av NaHS21. En annan möjlighet är att mycket låga koncentrationer av NaHS som finns kvar i lösning också kan ha en gynnsam effekt. Faktum är att Olson et al. gav bevis för att mikromolära nivåer av H2S i blodet inte är fysiologiska och bör ligga inom det nanomolära intervallet eller saknas helt och hållet13. H2S kan verka genom proteinsulfatering, en reversibel posttranslationell modifiering som påverkar funktionen, stabiliteten och lokaliseringen av många proteiner52,53,54. Faktum är att cirka 10 % till 25 % av många leverproteiner är sulfylerade under fysiologiska förhållanden53. Båda studierna bekräftar den snabba nedbrytningen av NaHS19,23 men konstaterar överraskande nog att ”vi kontrollerade koncentrationen av NaHS i dricksvatten genom att ersätta det dagligen.”23 En studie konstaterade av misstag att ”NaHS är en standard H2S-donator och används ofta i klinisk praxis för att ersätta H2S självt.”18
Ovanstående diskussion visar att NaHS förloras från lösning genom förångning, oxidation och fotolys, och därför ges några förslag för att minska förlusten av H2S från lösning. För det första beror avdunstningen av H2S på gas-vätske-gränssnittet13 och lösningens pH11; för att minimera avdunstningsförlusten kan därför vattenflaskans hals göras så liten som möjligt som beskrivits tidigare15,19, och vattnets pH kan justeras till en acceptabel övre gräns (dvs. 6,5–8,551) för att minimera avdunstningsförlusten11. För det andra sker spontan oxidation av H2S på grund av effekterna av syre och närvaron av övergångsmetalljoner i dricksvatten13, så deoxygenering av dricksvatten med argon eller kväve44,45 och användning av metallkelatorer37,47 kan minska oxidationen av sulfider. För det tredje, för att förhindra fotosönderdelning av H2S, kan vattenflaskor förpackas i aluminiumfolie; Denna praxis gäller även ljuskänsliga material såsom streptozotocin55. Slutligen kan oorganiska sulfidsalter (NaHS, Na2S och CaS) administreras via sondmatning snarare än att lösas upp i dricksvatten som tidigare rapporterats56,57,58; studier har visat att radioaktiv natriumsulfid som administreras via sondmatning till råttor absorberas väl och distribueras till praktiskt taget alla vävnader59. Hittills har de flesta studier administrerat oorganiska sulfidsalter intraperitonealt; denna väg används dock sällan i kliniska miljöer60. Å andra sidan är oral administrering den vanligaste och föredragna administreringsvägen hos människor61. Därför rekommenderar vi att man utvärderar effekterna av H2S-donatorer hos gnagare via oral sondmatning.
En begränsning är att vi mätte sulfid i vattenlösning och serum med hjälp av MB-metoden. Metoderna för att mäta sulfid inkluderar jodtitrering, spektrofotometri, elektrokemisk metod (potentiometri, amperometri, coulometrisk metod och amperometrisk metod) och kromatografi (gaskromatografi och högpresterande vätskekromatografi), bland vilka den vanligaste metoden är MB-spektrofotometriska metoden62. En begränsning med MB-metoden för att mäta H2S i biologiska prover är att den mäter alla svavelhaltiga föreningar och inte fritt H2S63 eftersom den utförs under sura förhållanden, vilket resulterar i extraktion av svavel från den biologiska källan64. Enligt American Public Health Association är dock MB standardmetoden för att mäta sulfid i vatten65. Därför påverkar denna begränsning inte våra huvudresultat om instabiliteten hos lösningar som innehåller NaHS. Dessutom var återvinningen av sulfidmätningar i vatten- och serumprover som innehåller NaHS i vår studie 91 % respektive 93 %. Dessa värden överensstämmer med tidigare rapporterade intervall (77–92)66, vilket indikerar acceptabel analytisk precision42. Det är värt att notera att vi använde både han- och honråttor i enlighet med National Institutes of Health (NIH) riktlinjer för att undvika överdriven förlitan på studier endast på hanar i prekliniska studier67 och för att inkludera både han- och honråttor när det är möjligt68. Denna punkt har betonats av andra69,70,71.
Sammanfattningsvis indikerar resultaten av denna studie att NaHS-lösningar framställda från dricksvatten inte kan användas för att generera H2S på grund av deras instabilitet. Denna administreringsväg skulle utsätta djur för instabila och lägre nivåer av NaHS än förväntat; därför kanske resultaten inte är tillämpliga på människor.
De dataset som använts och/eller analyserats under den aktuella studien är tillgängliga från motsvarande författare på rimlig begäran.
Szabo, K. Tidslinje för forskning om vätesulfid (H2S): från miljögifter till biologiska mediatorer. Biokemi och farmakologi 149, 5–19. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2017.09.010 (2018).
Abe, K. och Kimura, H. Möjlig roll för vätesulfid som en endogen neuromodulator. Journal of Neuroscience, 16, 1066–1071. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.16-03-01066.1996 (1996).
Chirino, G., Szabo, C. och Papapetropoulos, A. Fysiologisk roll av vätesulfid i däggdjursceller, vävnader och organ. Reviews in Physiology and Molecular Biology 103, 31–276. https://doi.org/10.1152/physrev.00028.2021 (2023).
Dillon, KM, Carrazzone, RJ, Matson, JB och Kashfi, K. Utvecklande löfte om cellulära leveranssystem för kväveoxid och vätesulfid: en ny era av personlig medicin. Biochemistry and Pharmacology 176, 113931. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2020.113931 (2020).
Sun, X., et al. Långtidsadministrering av en långsamt frisättande vätesulfiddonator kan förhindra myokardischemi/reperfusionsskada. Scientific reports 7, 3541. https://doi.org/10.1038/s41598-017-03941-0 (2017).
Sitdikova, GF, Fuchs, R., Kainz, W., Weiger, TM och Hermann, A. BK-kanalfosforylering reglerar vätesulfidkänsligheten (H2S). Frontiers in Physiology 5, 431. https://doi.org/10.3389/fphys.2014.00431 (2014).
Sitdikova, GF, Weiger, TM och Hermann, A. Vätesulfid ökar aktiviteten hos kalciumaktiverade kalium (BK)-kanaler i hypofystumörceller hos råtta. Archit. Pfluegers. 459, 389–397. https://doi.org/10.1007/s00424-009-0737-0 (2010).
Jeddy, S., et al. Vätesulfid förstärker den skyddande effekten av nitrit mot myokardiell ischemi-reperfusionsskada hos råttor med typ 2-diabetes. Nitric Oxide 124, 15–23. https://doi.org/10.1016/j.niox.2022.04.004 (2022).
Corvino, A., et al. Trender inom H2S-donatorkemi och dess inverkan på hjärt-kärlsjukdomar. Antioxidants 10, 429. https://doi.org/10.3390/antiox10030429 (2021).
DeLeon, ER, Stoy, GF, och Olson, KR (2012). Passiva förluster av vätesulfid i biologiska experiment. Analytical Biochemistry 421, 203–207. https://doi.org/10.1016/j.ab.2011.10.016 (2012).
Nagy, P., et al. Kemiska aspekter av vätesulfidmätningar i fysiologiska prover. Biochimica et Biophysical Acta 1840, 876–891. https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2013.05.037 (2014).
Kline, LL.D. Spektrofotometrisk bestämning av vätesulfid i naturliga vatten. Limnol. Oceanogr. 14, 454–458. https://doi.org/10.4319/lo.1969.14.3.0454 (1969).
Olson, KR (2012). Praktisk utbildning i vätesulfids kemi och biologi. ”Antioxidanter.” Redoxsignalering. 17, 32–44. https://doi.org/10.1089/ars.2011.4401 (2012).