Vi rapporterade tidigare att serumnivåerna av den tarmderiverade tryptofanmetaboliten indol-3-propionsyra (IPA) är lägre hos patienter med leverfibros. I denna studie undersökte vi transkriptomet och DNA-metylomet i överviktiga levrar i relation till serum-IPA-nivåer, samt IPAs roll i att inducera fenotypisk inaktivering av hepatiska stellatceller (HSC) in vitro.
Studien omfattade 116 överviktiga patienter utan typ 2-diabetes mellitus (T2DM) (ålder 46,8 ± 9,3 år; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m²) som genomgick bariatrisk kirurgi vid Kuopio Bariatric Surgery Center (KOBS). Cirkulerande IPA-nivåer mättes med vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS), levertranskriptomanalys utfördes med total RNA-sekvensering och DNA-metyleringsanalys utfördes med Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Humana leverstellatceller (LX-2) användes för in vitro-experiment.
Serumnivåer av IPA korrelerade med uttrycket av gener involverade i apoptotiska, mitofagiska och livslängdsvägar i levern. AKT-serin/treoninkinas 1 (AKT1)-genen var den vanligaste och dominanta interagerande genen i levertranskriptet och DNA-metyleringsprofilerna. IPA-behandling inducerade apoptos, minskade mitokondriell respiration och förändrade cellmorfologi och mitokondriell dynamik genom att modulera uttrycket av gener som är kända för att reglera fibros, apoptos och överlevnad av LX-2-celler.
Sammantaget stöder dessa data att IPA har potentiella terapeutiska effekter och kan inducera apoptos och förskjuta HSC-fenotypen mot ett inaktivt tillstånd, och därigenom utöka möjligheten att hämma leverfibros genom att störa HSC-aktivering och mitokondriell metabolism.
Förekomsten av fetma och metabolt syndrom har associerats med en ökande incidens av metaboliskt associerad fettleversjukdom (MASLD); sjukdomen drabbar 25 % till 30 % av den allmänna befolkningen [1]. Den huvudsakliga konsekvensen av MASLD-etiologin är leverfibros, en dynamisk process som kännetecknas av kontinuerlig ansamling av fibrös extracellulär matrix (ECM) [2]. De huvudsakliga cellerna som är involverade i leverfibros är hepatiska stellatceller (HSC), som uppvisar fyra kända fenotyper: vilande, aktiverade, inaktiverade och senescenta [3, 4]. HSC kan aktiveras och transdifferentieras från en vilande form till proliferativa fibroblastliknande celler med höga energibehov, med ökat uttryck av α-glattmuskelaktin (α-SMA) och typ I-kollagen (Col-I) [5, 6]. Under leverfibrosomvändning elimineras aktiverade HSC via apoptos eller inaktivering. Dessa processer inkluderar nedreglering av fibrogena gener och modulering av prosurvivala gener (såsom NF-κB och PI3K/Akt signalvägar) [7, 8], samt förändringar i mitokondriedynamik och funktion [9].
Serumnivåerna av tryptofanmetaboliten indol-3-propionsyra (IPA), som produceras i tarmen, har visat sig vara minskade vid mänskliga metabola sjukdomar, inklusive MASLD [10–13]. IPA är associerat med kostfiberintag, är känt för sina antioxidanta och antiinflammatoriska effekter, och försvagar den dietinducerade icke-alkoholiska steatohepatit (NASH)-fenotypen in vivo och in vitro [11–14]. Viss evidens kommer från vår tidigare studie, som visade att serumnivåerna av IPA var lägre hos patienter med leverfibros än hos överviktiga patienter utan leverfibros i Kuopio Bariatric Surgery Study (KOBS). Vidare visade vi att IPA-behandling kunde minska uttrycket av gener som är klassiska markörer för celladhesion, cellmigration och hematopoetisk stamcellsaktivering i en human hepatisk stellatcellsmodell (LX-2) och är en potentiell hepatoprotektiv metabolit [15]. Det är dock fortfarande oklart hur IPA inducerar leverfibrosregression genom att aktivera HSC-apoptos och mitokondriell bioenergetik.
Här visar vi att serum-IPA är associerat med uttrycket av gener berikade i apoptos, mitofagi och livslängdsvägar i levern hos överviktiga individer utan typ 2-diabetes (KOBS). Vidare fann vi att IPA kan inducera clearance och nedbrytning av aktiverade hematopoetiska stamceller (HSC) via inaktiveringsvägen. Dessa resultat avslöjar en ny roll för IPA, vilket gör det till ett potentiellt terapeutiskt mål för att främja leverfibrosregression.
En tidigare studie i KOBS-kohorten visade att patienter med leverfibros hade lägre cirkulerande IPA-nivåer jämfört med patienter utan leverfibros [15]. För att utesluta den potentiella störande effekten av typ 2-diabetes rekryterade vi 116 överviktiga patienter utan typ 2-diabetes (medelålder ± SD: 46,8 ± 9,3 år; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m2) (tabell 1) från den pågående KOBS-studien som studiepopulation [16]. Alla deltagare gav skriftligt informerat samtycke och studieprotokollet godkändes av etikprövningsnämnden vid Norra Savolax läns sjukhus i enlighet med Helsingforsdeklarationen (54/2005, 104/2008 och 27/2010).
Leverbiopsiprover togs under bariatrisk kirurgi och bedömdes histologiskt av erfarna patologer enligt tidigare beskrivna kriterier [17, 18]. Bedömningskriterierna sammanfattas i tilläggstabell S1 och har beskrivits tidigare [19].
Fastande serumprover analyserades med oriktad vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS) för metabolomikanalys (n = 116). Proverna analyserades med ett UHPLC-qTOF-MS-system (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Tyskland) enligt tidigare beskrivning19. Identifiering av isopropylalkohol (IPA) baserades på retentionstid och jämförelse av MS/MS-spektrumet med rena standarder. IPA-signalintensiteten (topparea) beaktades i alla ytterligare analyser [20].
Hellever-RNA-sekvensering utfördes med hjälp av Illumina HiSeq 2500 och data förbehandlades enligt tidigare beskrivning [19, 21, 22]. Vi utförde riktad differentiell expressionsanalys av transkript som påverkar mitokondriell funktion/biogenes med hjälp av 1957 gener valda från MitoMiner 4.0-databasen [23]. Lever-DNA-metyleringsanalys utfördes med hjälp av Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA) med samma metod som tidigare beskrivits [24, 25].
Humana leverstellatceller (LX-2) tillhandahölls vänligen av professor Stefano Romeo och odlades och hölls i DMEM/F12-medium (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). För att välja arbetsdosen av IPA behandlades LX-2-celler med olika koncentrationer av IPA (10 μM, 100 μM och 1 mM; Sigma, 220027) i DMEM/F12-medium i 24 timmar. För att undersöka IPAs förmåga att inaktivera HSC:er, sambehandlades LX-2-celler dessutom med 5 ng/ml TGF-β1 (R&D systems, 240-B-002/CF) och 1 mM IPA i serumfritt medium i 24 timmar. För motsvarande vehikelkontroller användes 4 nM HCL innehållande 0,1 % BSA för TGF-β1-behandling och 0,05 % DMSO för IPA-behandling, och båda användes tillsammans för kombinationsbehandlingen.
Apoptos utvärderades med hjälp av FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit med 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, USA, Cat# 640922) enligt tillverkarens instruktioner. Kortfattat odlades LX-2 (1 × 105 celler/brunn) över natten i plattor med 12 brunnar och behandlades sedan med flera doser av IPA eller IPA och TGF-β1. Följande dag samlades flytande och vidhäftande celler in, trypsinerades, tvättades med PBS, resuspenderades i Annexin V-bindningsbuffert och inkuberades med FITC-Annexin V och 7-AAD i 15 minuter.
Mitokondrier i levande celler färgades för oxidativ aktivitet med hjälp av Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). För MTR-analyser inkuberades LX-2-celler vid lika densiteter med IPA och TGF-β1. Efter 24 timmar trypsinerades levande celler, tvättades med PBS och inkuberades sedan med 100 μM MTR i serumfritt medium vid 37 °C i 20 minuter enligt tidigare beskrivning [26]. För morfologianalys av levande celler analyserades cellstorlek och cytoplasmisk komplexitet med hjälp av parametrar för forward scatter (FSC) respektive side scatter (SSC).
All data (30 000 händelser) samlades in med NovoCyte Quanteon (Agilent) och analyserades med hjälp av programvaran NovoExpress® 1.4.1 eller FlowJo V.10.
Syreförbrukningshastigheten (OCR) och extracellulär försurningshastighet (ECAR) mättes i realtid med hjälp av en Seahorse Extracellular Flux Analyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) utrustad med en Seahorse XF Cell Mito Stress enligt tillverkarens instruktioner. Kortfattat såddes 2 × 104 LX-2-celler/brunn på XF96-cellodlingsplattor. Efter inkubation över natten behandlades cellerna med isopropanol (IPA) och TGF-β1 (kompletterande metoder 1). Dataanalys utfördes med Seahorse XF Wave-programvara, som inkluderar Seahorse XF Cell Energy Phenotype Test Report Generator. Från detta beräknades ett bioenergetiskt hälsoindex (BHI) [27].
Totalt RNA transkriberades till cDNA. För specifika metoder, se referens [15]. MRNA-nivåer av humant 60S ribosomalt surt protein P0 (RPLP0) och cyklofilin A1 (PPIA) användes som konstitutiva genkontroller. QuantStudio 6 pro Real-Time PCR System (Thermo Fisher, Landsmeer, Nederländerna) användes med TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) eller Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050), och relativ genuttrycksveckning beräknades med hjälp av jämförande Ct-värdescyklingsparametrar (ΔΔCt) och ∆∆Ct-metoden. Detaljer om primrarna finns i tilläggstabellerna S2 och S3.
Kärn-DNA (ncDNA) och mitokondrie-DNA (mtDNA) extraherades med hjälp av DNeasy-blod- och vävnadskitet (Qiagen) enligt tidigare beskrivning [28]. Den relativa mängden mtDNA beräknades genom att beräkna förhållandet mellan varje mål-mtDNA-region och det geometriska medelvärdet av de tre kärn-DNA-regionerna (mtDNA/ncDNA), enligt beskrivningen i kompletterande metoder 2. Detaljer om primrarna för mtDNA och ncDNA finns i kompletterande tabell S4.
Levande celler färgades med Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) för att visualisera intercellulära och intracellulära mitokondriella nätverk. LX-2-celler (1 × 104 celler/brunn) odlades på objektglas i motsvarande glasbottnade odlingsplattor (Ibidi GmbH, Martinsried, Tyskland). Efter 24 timmar inkuberades levande LX-2-celler med 100 μM MTR i 20 minuter vid 37 °C och cellkärnor färgades med DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) enligt tidigare beskrivning [29]. Mitokondriella nätverk visualiserades med hjälp av ett inverterat Zeiss Axio Observer-mikroskop (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Tyskland) utrustat med en Zeiss LSM 800 konfokalmodul vid 37 °C i en fuktad atmosfär med 5 % CO2 med ett 63×NA 1.3-objektiv. Vi tog tio Z-seriebilder för varje provtyp. Varje Z-serie innehåller 30 sektioner, var och en med en tjocklek på 9,86 μm. För varje prov erhölls bilder av tio olika synfält med hjälp av ZEN 2009-programvaran (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Tyskland), och mitokondriell morfologianalys utfördes med ImageJ-programvaran (v1.54d) [30, 31] enligt de parametrar som beskrivs i kompletterande metoder 3.
Cellerna fixerades med 2 % glutaraldehyd i 0,1 M fosfatbuffert, följt av fixering med 1 % osmiumtetroxidlösning (Sigma Aldrich, MO, USA), dehydrerades gradvis med aceton (Merck, Darmstadt, Tyskland) och inbäddades slutligen i epoxiharts. Ultratunna snitt framställdes och färgades med 1 % uranylacetat (Merck, Darmstadt, Tyskland) och 1 % blycitrat (Merck, Darmstadt, Tyskland). Ultrastrukturella bilder erhölls med ett JEM 2100F EXII transmissionselektronmikroskop (JEOL Ltd, Tokyo, Japan) vid en accelerationsspänning på 80 kV.
Morfologin hos LX-2-celler behandlade med IPA i 24 timmar analyserades med faskontrastmikroskopi vid 50x förstoring med användning av ett Zeiss inverterat ljusmikroskop (Zeiss Axio Vert.A1 och AxioCam MRm, Jena, Tyskland).
Kliniska data uttrycktes som medelvärde ± standardavvikelse eller median (interkvartilintervall: IQR). Envägsvariansanalys (kontinuerliga variabler) eller χ²-test (kategoriska variabler) användes för att jämföra skillnader mellan de tre studiegrupperna. Falskt positiv frekvens (FDR) användes för att korrigera för multipel testning, och gener med FDR < 0,05 ansågs statistiskt signifikanta. Spearman-korrelationsanalys användes för att korrelera CpG-DNA-metylering med IPA-signalintensitet, med nominella p-värden (p < 0,05) rapporterade.
Levervägsanalys utfördes med hjälp av ett webbaserat verktyg för genuppsättningsanalys (WebGestalt) för 268 transkript (nominellt p < 0,01), 119 mitokondrieassocierade transkript (nominellt p < 0,05) och 4350 CpG av 3093 levertranskript som var associerade med cirkulerande serum-IPA-nivåer. Det fritt tillgängliga verktyget Venny DB (version 2.1.0) användes för att hitta överlappande gener, och StringDB (version 11.5) användes för att visualisera protein-protein-interaktioner.
För LX-2-experimentet testades proverna för normalitet med hjälp av D'Agostino-Pearson-testet. Data erhölls från minst tre biologiska replikat och utsattes för envägs ANOVA med Bonferroni post hoc-test. Ett p-värde på mindre än 0,05 ansågs statistiskt signifikant. Data presenteras som medelvärde ± SD, och antalet experiment anges i varje figur. Alla analyser och grafer utfördes med hjälp av den statistiska programvaran GraphPad Prism 8 för Windows (GraphPad Software Inc., version 8.4.3, San Diego, USA).
Först undersökte vi sambandet mellan serum-IPA-nivåer och lever-, helkropps- och mitokondriella transkript. I den totala transkriptprofilen var den starkaste genen associerad med serum-IPA-nivåer MAPKAPK3 (FDR = 0,0077; mitogenaktiverat proteinkinas-aktiverat proteinkinas 3); i den mitokondrierelaterade transkriptprofilen var den starkaste associerade genen AKT1 (FDR = 0,7621; AKT serin/treoninkinas 1) (Ytterligare fil 1 och Ytterligare fil 2).
Vi analyserade sedan globala transkript (n = 268; p < 0,01) och mitokondrieassocierade transkript (n = 119; p < 0,05), och identifierade slutligen apoptos som den mest signifikanta kanoniska signalvägen (p = 0,0089). För mitokondriella transkript associerade med serum-IPA-nivåer fokuserade vi på apoptos (FDR = 0,00001), mitofagi (FDR = 0,00029) och TNF-signalvägar (FDR = 0,000006) (Figur 1A, Tabell 2 och kompletterande Figur 1A-B).
Överlappande analys av globala, mitokondrieassocierade transkript och DNA-metylering i mänsklig lever i samband med serum-IPA-nivåer. A representerar 268 globala transkript, 119 mitokondrieassocierade transkript och DNA-metylerade transkript som är mappade till 3092 CpG-ställen associerade med serum-IPA-nivåer (p-värden < 0,01 för globala transkript och DNA-metylerat, och p-värden < 0,05 för mitokondriella transkript). De huvudsakliga överlappande transkripten visas i mitten (AKT1 och YKT6). B Interaktionskartan för de 13 generna med den högsta interaktionspoängen (0,900) med andra gener konstruerades från de 56 överlappande generna (svart linjeregion) som var signifikant associerade med serum-IPA-nivåer med hjälp av onlineverktyget StringDB. Grönt: Gener mappade till Gene Ontology (GO) cellkomponenten: mitokondrier (GO:0005739). AKT1 är proteinet med högst poäng (0,900) för interaktioner med andra proteiner baserat på data (baserat på text mining, experiment, databaser och samuttryck). Nätverksnoder representerar proteiner och kanter representerar kopplingar mellan proteiner.
Eftersom metaboliter i tarmfloran kan reglera epigenetisk sammansättning genom DNA-metylering [32] undersökte vi om serum-IPA-nivåer var associerade med lever-DNA-metylering. Vi fann att de två huvudsakliga metyleringsställena associerade med serum-IPA-nivåer var nära prolin-serin-rik region 3 (C19orf55) och värmechockproteinfamiljen B (liten) medlem 6 (HSPB6) (tilläggsfil 3). DNA-metylering av 4350 CpG (p < 0,01) korrelerade med serum-IPA-nivåer och var berikad med avseende på regleringsvägar för livslängd (p = 0,006) (Figur 1A, Tabell 2 och Kompletterande Figur 1C).
För att förstå de biologiska mekanismerna bakom sambanden mellan serum-IPA-nivåer, globala transkript, mitokondrieassocierade transkript och DNA-metylering i mänsklig lever, utförde vi en överlappningsanalys av de gener som identifierades i den tidigare signalvägsanalysen (Figur 1A). Resultaten av signalvägsanrikningsanalysen av de 56 överlappande generna (inuti den svarta linjen i Figur 1A) visade att apoptosvägen (p = 0,00029) lyfte fram två gener som är gemensamma för de tre analyserna: AKT1 och YKT6 (YKT6 v-SNARE-homolog), såsom visas i Venn-diagrammet (kompletterande Figur 2 och Figur 1A). Intressant nog fann vi att AKT1 (cg19831386) och YKT6 (cg24161647) var positivt korrelerade med serum-IPA-nivåer (Ytterligare fil 3). För att identifiera potentiella proteininteraktioner mellan genprodukter valde vi 13 gener med den högsta gemensamma regionens poäng (0,900) bland 56 överlappande gener som input och konstruerade en interaktionskarta. Enligt konfidensnivån (marginalkonfidens) låg AKT1-genen med den högsta poängen (0,900) högst upp (figur 1B).
Baserat på signalvägsanalysen fann vi att apoptos var den huvudsakliga signalvägen, så vi undersökte om IPA-behandling skulle påverka apoptosen hos HSC:er in vitro. Vi har tidigare visat att olika doser av IPA (10 μM, 100 μM och 1 mM) var giftfria för LX-2-celler [15]. Denna studie visade att IPA-behandling vid 10 μM och 100 μM ökade antalet livskraftiga och nekrotiska celler. Jämfört med kontrollgruppen minskade dock cellviabiliteten vid 1 mM IPA-koncentration, medan cellnekroshastigheten förblev oförändrad (Figur 2A, B). För att hitta den optimala koncentrationen för att inducera apoptos i LX-2-celler testade vi sedan 10 μM, 100 μM och 1 mM IPA i 24 timmar (Figur 2A-E och kompletterande Figur 3A-B). Intressant nog minskade IPA 10 μM och 100 μM apoptoshastigheten (%), däremot ökade IPA 1 mM sen apoptos och apoptoshastigheten (%) jämfört med kontrollgruppen och valdes därför för ytterligare experiment (figur 2A–D).
IPA inducerar apoptos av LX-2-celler. Annexin V och 7-AAD dubbelfärgningsmetod användes för att kvantifiera apoptoshastigheten och cellmorfologin med flödescytometri. BA-celler inkuberades med 10 μM, 100 μM och 1 mM IPA i 24 timmar eller med F–H TGF-β1 (5 ng/ml) och 1 mM IPA i serumfritt medium i 24 timmar. A: levande celler (Annexin V -/ 7AAD-); B: nekrotiska celler (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: tidiga (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: sena (Annexin V+/7AAD.+); E, H: andel av totala tidiga och sena apoptotiska celler i apoptoshastighet (%). Data uttrycks som medelvärde ± SD, n = 3 oberoende experiment. Statistiska jämförelser utfördes med envägs ANOVA med Bonferroni post hoc-test. *p < 0,05; ****p < 0,0001
Som vi tidigare visat kan 5 ng/ml TGF-β1 inducera HSC-aktivering genom att öka uttrycket av klassiska markörgener [15]. LX-2-celler behandlades med 5 ng/ml TGF-β1 och 1 mM IPA i kombination (Fig. 2E–H). TGF-β1-behandling förändrade inte apoptoshastigheten, men IPA-samtidig behandling ökade sen apoptos och apoptoshastighet (%) jämfört med TGF-β1-behandling (Fig. 2E–H). Dessa resultat indikerar att 1 mM IPA kan främja apoptos i LX-2-celler oberoende av TGF-β1-induktion.
Vi undersökte vidare effekten av IPA på mitokondriell respiration i LX-2-celler. Resultaten visade att 1 mM IPA minskade parametrarna för syreförbrukningshastigheten (OCR): icke-mitokondriell respiration, basal och maximal respiration, protonläckage och ATP-produktion jämfört med kontrollgruppen (Figur 3A, B), medan det bioenergetiska hälsoindexet (BHI) inte förändrades.
IPA minskar mitokondriell respiration i LX-2-celler. Den mitokondrielle respirationskurvan (OCR) presenteras som mitokondriella respirationsparametrar (icke-mitokondriell respiration, basal respiration, maximal respiration, protonläckage, ATP-generering, SRC och BHI). Cellerna A och B inkuberades med 10 μM, 100 μM respektive 1 mM IPA i 24 timmar. Cellerna C och D inkuberades med TGF-β1 (5 ng/ml) respektive 1 mM IPA i serumfritt medium i 24 timmar. Alla mätningar normaliserades till DNA-innehåll med hjälp av CyQuant-kitet. BHI: bioenergetiskt hälsoindex; SRC: respiratorisk reservkapacitet; OCR: syreförbrukningshastighet. Data presenteras som medelvärde ± standardavvikelse (SD), n = 5 oberoende experiment. Statistiska jämförelser utfördes med envägs ANOVA och Bonferroni post hoc-test. *p < 0,05; **p < 0,01; och ***p < 0,001
För att få en mer omfattande förståelse av effekten av IPA på den bioenergetiska profilen hos TGF-β1-aktiverade LX-2-celler analyserade vi mitokondriell oxidativ fosforylering med OCR (Fig. 3C, D). Resultaten visade att TGF-β1-behandling kunde minska maximal respiration, respiratorisk reservkapacitet (SRC) och BHI jämfört med kontrollgruppen (Fig. 3C, D). Dessutom minskade kombinationsbehandlingen basal respiration, protonläckage och ATP-produktion, men SRC och BHI var signifikant högre än de som behandlades med TGF-β1 (Fig. 3C, D).
Vi utförde även "Cellular Energy Phenotype Test" som tillhandahålls av Seahorse-programvaran (kompletterande figur 4A–D). Som visas i kompletterande figur 3B minskade både OCR- och ECAR-metaboliska potentialer efter TGF-β1-behandling, men ingen skillnad observerades i kombinations- och IPA-behandlingsgrupperna jämfört med kontrollgruppen. Dessutom minskade både basala och stressnivåerna av OCR efter kombinations- och IPA-behandling jämfört med kontrollgruppen (kompletterande figur 4C). Intressant nog observerades ett liknande mönster med kombinationsbehandling, där ingen förändring i basala och stressnivåer av ECAR observerades jämfört med TGF-β1-behandling (kompletterande figur 4C). I HSC:er förändrade inte minskningen av mitokondriell oxidativ fosforylering och kombinationsbehandlingens förmåga att återställa SCR och BHI efter exponering för TGF-β1-behandling den metaboliska potentialen (OCR och ECAR). Sammantaget indikerar dessa resultat att IPA kan minska bioenergetiken i HSC:er, vilket tyder på att IPA kan inducera en lägre energiprofil som förskjuter HSC-fenotypen mot inaktivering (kompletterande figur 4D).
Effekten av IPA på mitokondriedynamik undersöktes med hjälp av tredimensionell kvantifiering av mitokondriemorfologi och nätverkskopplingar samt MTR-färgning (Figur 4 och kompletterande Figur 5). Figur 4 visar att TGF-β1-behandling, jämfört med kontrollgruppen, minskade den genomsnittliga ytan, antalet grenar, den totala grenlängden och antalet grenövergångar (Figur 4A och B) och förändrade andelen mitokondrier från sfärisk till intermediär morfologi (Figur 4C). Endast IPA-behandling minskade den genomsnittliga mitokondrievolymen och förändrade andelen mitokondrier från sfärisk till intermediär morfologi jämfört med kontrollgruppen (Figur 4A). Däremot förblev sfäricitet, genomsnittlig grenlängd och mitokondrieaktivitet bedömd med mitokondriemembranpotentialberoende MTR (Figur 4A och E) oförändrade och dessa parametrar skilde sig inte mellan grupperna. Sammantaget tyder dessa resultat på att TGF-β1- och IPA-behandling verkar modulera mitokondrieform och storlek samt nätverkskomplexitet i levande LX-2-celler.
IPA förändrar mitokondriedynamik och förekomst av mitokondriellt DNA i LX-2-celler. A. Representativa konfokala bilder av levande LX-2-celler inkuberade med TGF-β1 (5 ng/ml) och 1 mM IPA i 24 timmar i serumfritt medium som visar mitokondriella nätverk färgade med Mitotracker™ Red CMXRos och kärnor färgade blå med DAPI. All data innehöll minst 15 bilder per grupp. Vi förvärvade 10 Z-stackbilder för varje provtyp. Varje Z-axelsekvens innehöll 30 skivor, var och en med en tjocklek på 9,86 μm. Skalstreck: 10 μm. B. Representativa objekt (endast mitokondrier) identifierade genom att tillämpa adaptiv tröskelvärde på bilden. Kvantitativ analys och jämförelse av mitokondriella morfologiska nätverkskopplingar utfördes för alla celler i varje grupp. C. Frekvens av mitokondriella formförhållanden. Värden nära 0 indikerar sfäriska former, och värden nära 1 indikerar filamentösa former. D Mitokondriellt DNA (mtDNA)-innehåll bestämdes enligt beskrivningen i Material och metoder. E Mitotracker™ Red CMXRos-analys utfördes med flödescytometri (30 000 händelser) enligt beskrivningen i Material och metoder. Data presenteras som medelvärde ± SD, n = 3 oberoende experiment. Statistiska jämförelser utfördes med envägs-ANOVA och Bonferroni post hoc-test. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Vi analyserade sedan mtDNA-innehållet i LX-2-celler som en indikator på mitokondriernas antal. Jämfört med kontrollgruppen var mtDNA-innehållet ökat i den TGF-β1-behandlade gruppen (Figur 4D). Jämfört med den TGF-β1-behandlade gruppen var mtDNA-innehållet minskat i kombinationsbehandlingsgruppen (Figur 4D), vilket tyder på att IPA kan minska mtDNA-innehållet och eventuellt mitokondriernas antal samt mitokondriell respiration (Figur 3C). Dessutom verkade IPA minska mtDNA-innehållet i kombinationsbehandlingen men påverkade inte MTR-medierad mitokondriell aktivitet (Figur 4A–C).
Vi undersökte sambandet mellan IPA och mRNA-nivåerna av gener associerade med fibros, apoptos, överlevnad och mitokondriedynamik i LX-2-celler (Figur 5A–D). Jämfört med kontrollgruppen uppvisade gruppen som behandlades med TGF-β1 ökat uttryck av gener såsom kollagen typ I α2-kedja (COL1A2), α-glattmuskelaktin (αSMA), matrixmetalloproteinas 2 (MMP2), vävnadshämmare av metalloproteinas 1 (TIMP1) och dynamin 1-liknande gen (DRP1), vilket indikerar ökad fibros och aktivering. Jämfört med kontrollgruppen minskade dessutom TGF-β1-behandling mRNA-nivåerna av nukleär pregnan X-receptor (PXR), caspas 8 (CASP8), MAPKAPK3, hämmare av B-cell α, förstärkare av nukleär faktor κ-genens ljuspeptid (NFκB1A) och hämmare av nukleär faktor κB-kinas-subenhet β (IKBKB) (Figur 5A–D). Jämfört med TGF-β1-behandling minskade kombinationsbehandling med TGF-β1 och IPA uttrycket av COL1A2 och MMP2, men ökade mRNA-nivåerna av PXR, TIMP1, B-cellslymfom-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β och IKBKB. IPA-behandling minskade signifikant uttrycket av MMP2, Bcl-2-associerat protein X (BAX), AKT1, optiskt atrofiprotein 1 (OPA1) och mitokondriellt fusionsprotein 2 (MFN2), medan uttrycket av CASP8, NFκB1A, NFκB1B och IKBKB ökade jämfört med kontrollgruppen. Emellertid hittades ingen skillnad i uttrycket av caspase-3 (CASP3), apoptotisk peptidasaktiverande faktor 1 (APAF1), mitokondriellt fusionsprotein 1 (MFN1) och fissionsprotein 1 (FIS1). Sammantaget tyder dessa resultat på att IPA-behandling modulerar uttrycket av gener associerade med fibros, apoptos, överlevnad och mitokondriedynamik. Våra data tyder på att IPA-behandling minskar fibros i LX-2-celler; samtidigt stimulerar den överlevnad genom att förskjuta fenotypen mot inaktivering.
IPA modulerar uttrycket av fibroblast-, apoptotiska, viabilitets- och mitokondriedynamikgener i LX-2-celler. Histogram visar mRNA-uttryck i förhållande till endogen kontroll (RPLP0 eller PPIA) efter att LX-2-celler inducerats med TGF-β1 och IPA i serumfritt medium i 24 timmar. A indikerar fibroblaster, B indikerar apoptotiska celler, C indikerar överlevande celler och D indikerar mitokondriedynamikgenuttryck. Data presenteras som medelvärde ± standardavvikelse (SD), n = 3 oberoende experiment. Statistiska jämförelser utfördes med envägs-ANOVA och Bonferroni post hoc-test. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Därefter utvärderades förändringar i cellstorlek (FSC-H) och cytoplasmisk komplexitet (SSC-H) med flödescytometri (Figur 6A, B), och förändringar i cellmorfologi efter IPA-behandling utvärderades med transmissionselektronmikroskopi (TEM) och faskontrastmikroskopi (Kompletterande Figur 6A-B). Som förväntat ökade cellerna i den TGF-β1-behandlade gruppen i storlek jämfört med kontrollgruppen (Figur 6A, B), vilket visar den klassiska expansionen av grovt endoplasmatiskt retikulum (ER*) och fagolysosomer (P), vilket indikerar aktivering av hematopoetiska stamceller (HSC) (Kompletterande Figur 6A). Jämfört med den TGF-β1-behandlade gruppen minskade dock cellstorleken, cytoplasmisk komplexitet (Fig. 6A, B) och ER*-innehållet i gruppen som fick kombinationen TGF-β1 och IPA (Kompletterande Figur 6A). Dessutom minskade IPA-behandling cellstorleken, cytoplasmisk komplexitet (Fig. 6A, B), P- och ER*-innehållet (Kompletterande Figur 6A) jämfört med kontrollgruppen. Dessutom ökade innehållet av apoptotiska celler efter 24 timmars IPA-behandling jämfört med kontrollgruppen (vita pilar, kompletterande figur 6B). Sammantaget tyder dessa resultat på att 1 mM IPA kan stimulera HSC-apoptos och reversera förändringarna i cellmorfologiska parametrar inducerade av TGF-β1, och därigenom reglera cellstorleken och komplexiteten, vilket kan vara associerat med HSC-inaktivering.
IPA förändrar cellstorlek och cytoplasmisk komplexitet i LX-2-celler. Representativa bilder av flödescytometrianalys. Analysen använde en gatingstrategi specifik för LX-2-celler: SSC-A/FSC-A för att definiera cellpopulationen, FSC-H/FSC-A för att identifiera dubbletter och SSC-H/FSC-H för cellstorleks- och komplexitetsanalys. Cellerna inkuberades med TGF-β1 (5 ng/ml) och 1 mM IPA i serumfritt medium i 24 timmar. LX-2-celler fördelades i nedre vänstra kvadranten (SSC-H-/FSC-H-), övre vänstra kvadranten (SSC-H+/FSC-H-), nedre högra kvadranten (SSC-H-/FSC-H+) och övre högra kvadranten (SSC-H+/FSC-H+) för cellstorleks- och cytoplasmisk komplexitetsanalys. B. Cellmorfologin analyserades med flödescytometri med FSC-H (forward scatter, cellstorlek) och SSC-H (sidospridning, cytoplasmisk komplexitet) (30 000 händelser). Data presenteras som medelvärde ± SD, n = 3 oberoende experiment. Statistiska jämförelser utfördes med envägs-ANOVA och Bonferroni post hoc-test. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 och ****p < 0,0001
Tarmmetaboliter som IPA har blivit ett hett forskningsämne, vilket tyder på att nya mål kan upptäckas i tarmfloran. Det är därför intressant att IPA, en metabolit som vi har kopplat till leverfibros hos människor [15], har visat sig vara en potentiell antifibrotisk förening i djurmodeller [13, 14]. Här visar vi för första gången ett samband mellan serum-IPA och global levertranskriptomik och DNA-metylering hos överviktiga individer utan typ 2-diabetes (T2D), vilket belyser apoptos, mitofagi och livslängd, samt en möjlig kandidatgen AKT1 som reglerar leverhomeostas. En annan nyhet i vår studie är att vi demonstrerade interaktionen mellan IPA-behandling och apoptos, cellmorfologi, mitokondriell bioenergetik och dynamik i LX-2-celler, vilket indikerar ett lägre energispektrum som förskjuter HSC-fenotypen mot inaktivering, vilket gör IPA till en potentiell kandidat för att förbättra leverfibros.
Vi fann att apoptos, mitofagi och livslängd var de viktigaste kanoniska vägarna berikade i levergener associerade med cirkulerande serum-IPA. Störningar i det mitokondriella kvalitetskontrollsystemet (MQC) kan leda till mitokondriell dysfunktion, mitofagi och apoptos, vilket därigenom främjar förekomsten av MASLD [33, 34]. Därför kan vi spekulera i att IPA kan vara involverat i att upprätthålla celldynamik och mitokondriell integritet genom apoptos, mitofagi och livslängd i levern. Våra data visade att två gener var vanliga i de tre analyserna: YKT6 och AKT1. Det är värt att notera att YKT6 är ett SNARE-protein som är involverat i processen för cellmembranfusion. Det spelar en roll i autofagi och mitofagi genom att bilda ett initieringskomplex med STX17 och SNAP29 på autofagosomen, vilket därigenom främjar fusionen av autofagosomer och lysosomer [35]. Dessutom leder förlust av YKT6-funktion till försämrad mitofagi [36], medan uppreglering av YKT6 är associerad med utvecklingen av hepatocellulärt karcinom (HCC), vilket visar ökad cellöverlevnad [37]. Å andra sidan är AKT1 den viktigaste interagerande genen och spelar en viktig roll i leversjukdomar, inklusive PI3K/AKT-signalvägen, cellcykel, cellmigration, proliferation, fokal adhesion, mitokondriell funktion och kollagensekretion [38–40]. Aktiverad PI3K/AKT-signalväg kan aktivera hematopoetiska stamceller (HSC), vilka är de celler som ansvarar för produktionen av extracellulär matrix (ECM), och dess dysreglering kan bidra till uppkomsten och utvecklingen av leverfibros [40]. Dessutom är AKT en av de viktigaste cellöverlevnadsfaktorerna som hämmar p53-beroende cellapoptos, och AKT-aktivering kan vara associerad med hämningen av levercellapoptos [41, 42]. De erhållna resultaten tyder på att IPA kan vara involverad i levermitokondriassocierad apoptos genom att påverka hepatocyternas beslut mellan att gå in i apoptos eller överleva. Dessa effekter kan regleras av AKT- och/eller YKT6-kandidatgener, vilka är avgörande för leverhomeostas.
Våra resultat visade att 1 mM IPA inducerade apoptos och minskade mitokondriell respiration i LX-2-celler oberoende av TGF-β1-behandling. Det är anmärkningsvärt att apoptos är en viktig väg för fibrosupplösning och aktivering av hematopoetiska stamceller (HSC), och är också en nyckelhändelse i det reversibla fysiologiska svaret på leverfibros [4, 43]. Dessutom gav återställandet av BHI i LX-2-celler efter kombinationsbehandling nya insikter i IPAs potentiella roll i regleringen av mitokondriell bioenergetik. Under vilande och inaktiva förhållanden använder hematopoetiska celler normalt mitokondriell oxidativ fosforylering för att producera ATP och har låg metabolisk aktivitet. Å andra sidan förbättrar HSC-aktivering mitokondriell respiration och biosyntes för att kompensera för energibehovet för att gå in i det glykolytiska tillståndet [44]. Det faktum att IPA inte påverkade metabolisk potential och ECAR tyder på att den glykolytiska vägen är mindre prioriterad. På liknande sätt visade en annan studie att 1 mM IPA kunde modulera mitokondriell respiratorisk kedjeaktivitet i kardiomyocyter, humana hepatocytcellinjer (Huh7) och humana navelvensendotelceller (HUVEC); Ingen effekt av IPA hittades dock på glykolys i kardiomyocyter, vilket tyder på att IPA kan påverka bioenergetiken hos andra celltyper [45]. Därför spekulerar vi i att 1 mM IPA kan fungera som en mild kemisk avkopplare, eftersom den avsevärt kan minska fibrogent genuttryck, cellmorfologi och mitokondriell bioenergetik utan att ändra mängden mtDNA [46]. Mitokondriella avkopplare kan hämma kulturinducerad fibros och HSC-aktivering [47] och minska mitokondriell ATP-produktion som regleras eller induceras av vissa proteiner såsom avkopplingsproteiner (UCP) eller adeninnukleotidtranslokas (ANT). Beroende på celltyp kan detta fenomen skydda celler från apoptos och/eller främja apoptos [46]. Ytterligare studier behövs dock för att belysa IPAs roll som en mitokondriell avkopplare vid inaktivering av hematopoetiska stamceller.
Vi undersökte sedan om förändringarna i mitokondriell respiration återspeglas i mitokondriemorfologin i levande LX-2-celler. Intressant nog förändrar TGF-β1-behandling mitokondrieproportionen från sfärisk till intermediär, med minskad mitokondriell förgrening och ökat uttryck av DRP1, en nyckelfaktor i mitokondriell fission [48]. Dessutom är mitokondriell fragmentering associerad med övergripande nätverkskomplexitet, och övergången från fusion till fission är avgörande för aktivering av hematopoetiska stamceller (HSC), medan hämning av mitokondriell fission leder till HSC-apoptos [49]. Således indikerar våra resultat att TGF-β1-behandling kan inducera en minskning av mitokondrienätverkskomplexitet med minskad förgrening, vilket är vanligare vid mitokondriell fission associerad med aktiverade hematopoetiska stamceller (HSC). Dessutom visade våra data att IPA kunde ändra andelen mitokondrier från sfärisk till intermediär form, vilket minskar uttrycket av OPA1 och MFN2. Studier har visat att nedreglering av OPA1 kan orsaka en minskning av mitokondriemembranpotential och utlösa cellapoptos [50]. MFN2 är känt för att mediera mitokondriell fusion och apoptos [51]. De erhållna resultaten tyder på att induktion av LX-2-celler med TGF-β1 och/eller IPA verkar modulera mitokondrieform och storlek, såväl som aktiveringstillstånd och nätverkskomplexitet.
Våra resultat indikerar att kombinationsbehandlingen med TGFβ-1 och IPA kan minska mtDNA och cellmorfologiska parametrar genom att reglera mRNA-uttrycket av fibros, apoptos och överlevnadsrelaterade gener i apoptosundvikande celler. IPA minskade visserligen mRNA-uttrycksnivån av AKT1 och viktiga fibrosgener såsom COL1A2 och MMP2, men ökade uttrycksnivån av CASP8, vilket är associerat med apoptos. Våra resultat visade att efter IPA-behandling minskade BAX-uttrycket och mRNA-uttrycket av TIMP1-familjesubenheter, BCL-2 och NF-κB ökade, vilket tyder på att IPA kan stimulera överlevnadssignaler i hematopoetiska stamceller (HSC) som undviker apoptos. Dessa molekyler kan fungera som pro-överlevnadssignaler i aktiverade hematopoetiska stamceller, vilket kan vara associerat med ökat uttryck av anti-apoptotiska proteiner (såsom Bcl-2), minskat uttryck av pro-apoptotisk BAX och ett komplext samspel mellan TIMP och NF-κB [5, 7]. IPA utövar sina effekter genom PXR, och vi fann att kombinationsbehandling med TGF-β1 och IPA ökade PXR mRNA-uttrycksnivåerna, vilket indikerar hämning av HSC-aktivering. Aktiverad PXR-signalering är känd för att hämma HSC-aktivering både in vivo och in vitro [52, 53]. Våra resultat indikerar att IPA kan delta i elimineringen av aktiverade HSC genom att främja apoptos, minska fibros och mitokondriell metabolism, och förbättra överlevnadssignaler, vilka är typiska processer som omvandlar den aktiverade HSC-fenotypen till en inaktiverad. En annan möjlig förklaring till den potentiella mekanismen och rollen för IPAs roll i apoptos är att den rensar dysfunktionella mitokondrier främst genom mitofagi (intrinsisk signalväg) och den extrinsiska TNF-signalvägen (tabell 1), som är direkt kopplad till NF-κB-överlevnadssignalvägen (kompletterande figur 7). Intressant nog kan IPA-relaterade berikade gener inducera pro-apoptotiska och pro-överlevnadssignaler i den apoptotiska vägen [54], vilket tyder på att IPA kan inducera den apoptotiska vägen eller överlevnad genom att interagera med dessa gener. Hur IPA inducerar apoptos eller överlevnad under HSC-aktivering och dess mekanistiska vägar är dock fortfarande oklara.
IPA är en mikrobiell metabolit som bildas från tryptofan i kosten via tarmfloran. Studier har visat att den har antiinflammatoriska, antioxidativa och epigenetiska reglerande egenskaper i tarmmiljön.[55] Studier har visat att IPA kan modulera tarmbarriärfunktionen och minska oxidativ stress, vilket kan bidra till dess lokala fysiologiska effekter.[56] Faktum är att IPA transporteras till målorgan via cirkulationen, och eftersom IPA delar en liknande huvudsaklig metabolitstruktur med tryptofan, serotonin och indolderivat, utövar IPA metaboliska effekter som resulterar i konkurrensutsatta metaboliska öden.[52] IPA kan konkurrera med tryptofan-deriverade metaboliter om bindningsställen på enzymer eller receptorer, vilket potentiellt stör normala metaboliska vägar. Detta belyser behovet av ytterligare studier av dess farmakokinetik och farmakodynamik för att bättre förstå dess terapeutiska fönster.[57] Det återstår att se om detta också kan förekomma i hematopoetiska stamceller (HSC).
Vi är medvetna om att vår studie har vissa begränsningar. För att specifikt undersöka samband relaterade till IPA exkluderade vi patienter med typ 2-diabetes mellitus (T2DM). Vi är medvetna om att detta begränsar den breda tillämpbarheten av våra resultat på patienter med typ 2-diabetes mellitus och avancerad leversjukdom. Även om den fysiologiska koncentrationen av IPA i humant serum är 1–10 μM [11, 20], valdes en koncentration på 1 mM IPA baserat på den högsta icke-toxiska koncentrationen [15] och den högsta apoptosfrekvensen, utan skillnad i andelen nekrotiska cellpopulationer. Även om suprafysiologiska nivåer av IPA användes i denna studie finns det för närvarande ingen konsensus om den effektiva dosen av IPA [52]. Även om våra resultat är signifikanta, förblir den bredare metaboliska ödet för IPA ett aktivt forskningsområde. Dessutom erhölls våra resultat om sambandet mellan serum-IPA-nivåer och DNA-metylering av levertranskript inte bara från hematopoetiska stamceller (HSC) utan även från levervävnader. Vi valde att använda humana LX-2-celler baserat på våra tidigare fynd från transkriptomanalys att IPA är associerat med aktivering av hematopoetiska stamceller (HSC) [15], och att HSC är de viktigaste cellerna som är involverade i utvecklingen av leverfibros. Levern består av flera celltyper, så andra cellmodeller såsom hepatocyt-HSC-immuncells-samodlingssystem i kombination med kaspasaktivering och DNA-fragmentering samt verkningsmekanismen inklusive proteinnivå bör övervägas för att studera IPA:s roll och dess interaktion med andra levercelltyper.