Olika teorier om växtförsvar ger viktig teoretisk vägledning för att förklara mönstren för växtspecialiserad metabolism, men deras viktigaste förutsägelser behöver fortfarande testas. Här använde vi opartisk tandem-masspektrometri (MS/MS)-analys för att systematiskt utforska metabolomet hos tobaksförsvagade stammar från enskilda växter till populationer och närbesläktade arter, och bearbetade ett stort antal masspektrometriska egenskapsteorier baserade på sammansatta spektra i informationsramverket för att testa de viktigaste förutsägelserna om optimalt försvar (OD) och rörliga mål (MT) teorier. Informationskomponenten i växtmetabolomik överensstämmer med OD-teorin, men motsäger den huvudsakliga förutsägelsen i MT-teorin om metabolomikdynamik orsakad av växtätare. Från mikro- till makroevolutionär skala identifierades jasmonatsignalen som den viktigaste avgörande faktorn för OD, medan etylensignalen gav finjustering av det växtätarspecifika svaret annoterat av MS/MS-molekylnätverket.
Speciella metaboliter med olika strukturer är de viktigaste deltagarna i växters anpassning till miljön, särskilt i försvaret av fiender (1). Den fantastiska diversifieringen av den speciella metabolism som finns i växter har stimulerat årtionden av djupgående forskning om dess många aspekter av ekologiska funktioner och har bildat en lång lista med växtförsvarsteorier, vilka är den evolutionära och ekologiska utvecklingen av växt-insektsinteraktioner. Empirisk forskning ger viktig vägledning (2). Dessa växtförsvarsteorier följde dock inte den normativa vägen för hypotetiskt deduktivt resonemang, där viktiga förutsägelser var på samma analysnivå (3) och testades experimentellt för att avancera nästa cykel av teoretisk utveckling (4). Tekniska begränsningar begränsar datainsamlingen till specifika metaboliska kategorier och utesluter omfattande analys av specialiserade metaboliter, vilket förhindrar jämförelser mellan kategorier som är avgörande för teoretisk utveckling (5). Bristen på omfattande metabolomikdata och en gemensam valuta för att jämföra bearbetningsflödet i det metaboliska utrymmet mellan olika växtgrupper hindrar fältets vetenskapliga mognad.
Den senaste utvecklingen inom tandemmasspektrometri (MS/MS) metabolomik kan heltäckande karakterisera de metaboliska förändringarna inom och mellan arter i en given systemklad, och kan kombineras med beräkningsmetoder för att beräkna den strukturella likheten mellan dessa komplexa blandningar. Förkunskaper i kemi (5). Kombinationen av avancerad teknik inom analys och databehandling ger ett nödvändigt ramverk för långsiktig testning av många förutsägelser gjorda av de ekologiska och evolutionära teorierna om metabolisk mångfald. Shannon (6) introducerade informationsteori för första gången i sin banbrytande artikel 1948 och lade grunden för den matematiska analysen av information, som har använts inom många andra områden än dess ursprungliga tillämpning. Inom genomik har informationsteori framgångsrikt tillämpats för att kvantifiera sekvenskonservativ information (7). Inom transkriptomikforskning analyserar informationsteori de övergripande förändringarna i transkriptomet (8). I tidigare forskning tillämpade vi det statistiska ramverket för informationsteori på metabolomik för att beskriva den metaboliska expertisen på vävnadsnivå i växter (9). Här kombinerar vi det MS/MS-baserade arbetsflödet med det statistiska ramverket för informationsteori, kännetecknat av den metaboliska mångfalden i den gemensamma valutan, för att jämföra de viktigaste förutsägelserna från växtförsvarsteorin för metabolomet inducerat av växtätare.
De teoretiska ramverken för växtförsvar är vanligtvis ömsesidigt inkluderande och kan delas in i två kategorier: de som försöker förklara fördelningen av växtspecifika metaboliter baserat på försvarsfunktioner, såsom optimalt försvar (OD) (10), rörligt mål (MT) (11) och utseendesteori (12), medan andra söker mekaniska förklaringar till hur förändringar i resurstillgång påverkar växttillväxt och ackumulering av specialiserade metaboliter, såsom kol: näringsbalanshypotesen (13), tillväxthastighetshypotesen (14) och tillväxt- och differentieringsjämviktshypotesen (15). De två uppsättningarna teorier befinner sig på olika analysnivåer (4). Två teorier som involverar defensiva funktioner på funktionell nivå dominerar dock samtalet om växters konstitutiva och inducerbara försvar: OD-teorin, som antar att växter investerar i sina dyra kemiska försvar endast när det behövs, till exempel när de förtärs. När ett gräsdjur attackerar tilldelas därför, beroende på möjligheten till framtida attack, föreningen med en defensiv funktion (10); MT-hypotesen föreslår att det inte finns någon axel för riktad metabolitförändring, utan metaboliten förändras slumpmässigt, vilket skapar möjligheten att hindra det metaboliska "rörelsemålet" hos angripande växtätare. Med andra ord gör dessa två teorier motsatta förutsägelser om den metaboliska ombyggnad som sker efter en attack av växtätare: sambandet mellan den enriktade ackumuleringen av metaboliter med defensiv funktion (OD) och icke-riktade metaboliska förändringar (MT) (11).
OD- och MT-hypoteserna involverar inte bara de inducerade förändringarna i metabolomet, utan även de ekologiska och evolutionära konsekvenserna av ackumuleringen av dessa metaboliter, såsom de adaptiva kostnaderna och fördelarna med dessa metaboliska förändringar i en specifik ekologisk miljö (16). Även om båda hypoteserna erkänner den defensiva funktionen hos specialiserade metaboliter, som kan vara dyra eller inte, ligger den viktigaste förutsägelsen som skiljer OD- och MT-hypoteserna åt i riktningen hos de inducerade metaboliska förändringarna. Förutsägelsen av OD-teorin har hittills fått mest experimentell uppmärksamhet. Dessa tester inkluderar studier av de direkta eller indirekta försvarsfunktionerna hos olika vävnader av specifika föreningar i växthus och naturliga förhållanden, samt förändringar i växternas utvecklingsstadium (17-19). Men hittills, på grund av bristen på ett arbetsflöde och statistiskt ramverk för global omfattande analys av metabolisk mångfald hos någon organism, återstår den huvudsakliga skillnaden i förutsägelsen mellan de två teorierna (det vill säga riktningen för metaboliska förändringar) att testas. Här tillhandahåller vi en sådan analys.
En av de viktigaste egenskaperna hos växtspecifika metaboliter är deras extrema strukturella mångfald på alla nivåer, från enskilda växter och populationer till liknande arter (20). Många kvantitativa förändringar i specialiserade metaboliter kan observeras på populationsnivå, medan starka kvalitativa skillnader vanligtvis bibehålls på artnivå (20). Därför är växtmetabolisk mångfald den viktigaste aspekten av funktionell mångfald, vilket återspeglar anpassningsförmågan till olika nischer, särskilt de nischer med olika invasionsmöjligheter av speciella insekter och vanliga växtätare (21). Sedan Fraenkels (22) banbrytande artikel om orsakerna till existensen av växtspecifika metaboliter har interaktioner med olika insekter betraktats som viktiga selektionstryck, och dessa interaktioner tros ha format växter under evolutionen. Metabolisk väg (23). Skillnader mellan arter i mångfalden av specialiserade metaboliter kan också återspegla den fysiologiska balansen som är förknippad med konstitutivt och inducerbart växtförsvar mot växtätande strategier, eftersom de två arterna ofta är negativt korrelerade med varandra (24). Även om det kan vara fördelaktigt att upprätthålla ett gott försvar hela tiden, ger snabba metaboliska förändringar i samband med försvaret tydliga fördelar genom att låta växter allokera värdefulla resurser till andra fysiologiska investeringar (19, 24) och undvika behovet av symbios. Kollaterala skador (25). Dessutom kan dessa omorganisationer av specialiserade metaboliter orsakade av insektsherbivorer leda till destruktiv distribution i populationen (26) och kan återspegla direkta avläsningar av betydande naturliga förändringar i jasmonsyra (JA)-signalen, som kan bibehållas i populationen. Höga och låga JA-signaler är avvägningar mellan försvar mot herbivorer och konkurrens med specifika arter (27). Dessutom kommer specialiserade metabolitbiosyntetiska vägar att genomgå snabb förlust och transformation under evolutionen, vilket resulterar i ojämn metabolisk distribution bland närbesläktade arter (28). Dessa polymorfismer kan snabbt etableras som svar på förändrade herbivormönster (29), vilket innebär att fluktuationerna i herbivorsamhällen är en nyckelfaktor som driver metabolisk heterogenitet.
Här löste vi specifikt följande problem. (I) Hur omkonfigurerar den växtätande insekten växtmetabolomet? (Ii) Vilka är de viktigaste informationskomponenterna i metabolisk plasticitet som kan kvantifieras för att testa förutsägelserna i teorin om långsiktigt försvar? (Iii) Huruvida växtmetabolomet ska omprogrammeras på ett sätt som är unikt för angriparen, och i så fall vilken roll spelar växthormon för att skräddarsy ett specifikt metaboliskt svar, och vilka metaboliter bidrar till försvarets artspecificitet? (Iv) Eftersom förutsägelserna som görs av många försvarsteorier kan utvidgas till alla nivåer av biologiska vävnader, frågade vi oss hur konsekvent det orsakade metaboliska svaret är från intern jämförelse till jämförelse mellan arter? För detta ändamål har vi systematiskt studerat bladmetabolomet av tobaksnikotin, vilket är en ekologisk modellväxt med rik specialiserad metabolism, och är effektiv mot larverna hos två inhemska växtätare, Lepidoptera Datura (Ms) (mycket aggressiv, huvudsakligen äten). På Solanaceae och Spodoptera littoralis (Sl) är bomullsbladmaskar ett slags "släkte", med värdväxter från Solanaceae och andra värdväxter från andra släkten och familjer växtnäring. Vi analyserade MS/MS-metabolomikspektrumet och extraherade informationsteoriens statistiska deskriptorer för att jämföra OD- och MT-teorier. Skapa specificitetskartor för att avslöja identiteten hos viktiga metaboliter. Analysen utvidgades till den inhemska populationen av N. nasi och närbesläktade tobaksarter för att ytterligare analysera kovariansen mellan växthormonsignalering och OD-induktion.
För att skapa en övergripande karta över plasticiteten och strukturen hos bladmetabolomet hos växtätande tobak, använde vi ett tidigare utvecklat analys- och beräkningsarbetsflöde för att heltäckande samla in och dekonvolvera högupplösta dataoberoende MS/MS-spektra från växtextrakt (9). Denna odifferentierade metod (kallad MS/MS) kan konstruera icke-redundanta föreningsspektra, som sedan kan användas för alla analyser på föreningsnivå som beskrivs här. Dessa dekonvolverade växtmetaboliter är av olika typer, bestående av hundratals till tusentals metaboliter (cirka 500-1000-s/MS/MS här). Här betraktar vi metabolisk plasticitet inom ramen för informationsteori och kvantifierar metabolomets mångfald och professionalism baserat på Shannon-entropin för den metaboliska frekvensfördelningen. Med hjälp av den tidigare implementerade formeln (8) beräknade vi en uppsättning indikatorer som kan användas för att kvantifiera metabolomdiversitet (Hj-indikator), metabolisk profilspecialisering (δj-indikator) och metabolisk specificitet hos en enda metabolit (Si-indikator). Dessutom använde vi Relative Distance Plasticity Index (RDPI) för att kvantifiera metabolominducerbarheten hos växtätare (Figur 1A) (30). Inom detta statistiska ramverk behandlar vi MS/MS-spektrum som den grundläggande informationsenheten och bearbetar den relativa förekomsten av MS/MS till en frekvensfördelningskarta, och använder sedan Shannon-entropi för att uppskatta metabolomdiversiteten utifrån den. Metabolomspecialiseringen mäts med den genomsnittliga specificiteten för ett enda MS/MS-spektrum. Därför omvandlas ökningen i förekomsten av vissa MS/MS-klasser efter växtätarinduktion till spektral inducerbarhet, RDPI och specialisering, det vill säga ökningen av δj-indexet, eftersom mer specialiserade metaboliter produceras och ett högt Si-index produceras. Sänkningen av Hj-diversitetsindexet återspeglar att antingen antalet genererade MS/MS minskas, eller att profilfrekvensfördelningen ändras i en mindre enhetlig riktning, samtidigt som dess totala osäkerhet minskar. Genom Si-indexberäkningen är det möjligt att markera vilka MS/MS som induceras av vissa växtätare, tvärtom vilka MS/MS som inte svarar på induktionen, vilket är en nyckelindikator för att skilja mellan MT- och OD-prediktion.
(A) Statistiska deskriptorer som används för växtätande (H1 till Hx) MS/MS-datainducerbarhet (RDPI), diversitet (Hj-index), specialisering (δj-index) och metabolitspecificitet (Si-index). En ökning av specialiseringsgraden (δj) indikerar att i genomsnitt fler växtätande specifika metaboliter kommer att produceras, medan en minskning av diversitet (Hj) indikerar en minskning av produktionen av metaboliter eller ojämn fördelning av metaboliter på distributionskartan. Si-värdet bedömer om metaboliten är specifik för ett givet tillstånd (här växtätande) eller omvänt bibehålls på samma nivå. (B) Konceptuellt diagram över försvarsteoriprediktion med hjälp av informationsteoriaxeln. OD-teorin förutsäger att växtätande attacker kommer att öka försvarsmetaboliterna, och därigenom öka δj. Samtidigt minskar Hj eftersom profilen omorganiseras mot den minskade osäkerheten i metabolisk information. MT-teorin förutspår att attacker från växtätare kommer att orsaka icke-riktade förändringar i metabolomet, vilket därigenom ökar Hj som en indikator på ökad osäkerhet i metabolisk information och orsakar en slumpmässig fördelning av Si. Vi föreslog också en blandad modell, den bästa MT, där vissa metaboliter med högre defensiva värden kommer att öka särskilt mycket (högt Si-värde), medan andra uppvisar slumpmässiga svar (lägre Si-värde).
Med hjälp av informationsteorins deskriptorer tolkar vi OD-teorin för att förutsäga att herbivorinducerade speciella metabolitförändringar i ett oinducerat konstitutivt tillstånd kommer att leda till (i) en ökning av metabolisk specificitet (Si-index) vilket driver metabonomisk specificitet (δj-index), ökningen av vissa speciella metabolitgrupper med högre försvarsvärde, och (ii) minskningen av metabolomdiversitet (Hj-index) på grund av förändringen av metabolisk frekvensfördelning till mer leptinfördelning i kroppen. På nivån av en enskild metabolit förväntas en ordnad Si-fördelning, där metaboliten kommer att öka Si-värdet i enlighet med dess försvarsvärde (Figur 1B). I linje med detta förklarar vi MT-teorin för att förutsäga att excitation kommer att leda till (i) icke-riktade förändringar i metaboliter vilket resulterar i en minskning av δj-index, och (ii) en ökning av Hj-index på grund av en ökning av metabolisk osäkerhet. Eller slumpmässighet, vilket kan kvantifieras med Shannon-entropi i form av generaliserad diversitet. När det gäller den metaboliska sammansättningen kommer MT-teorin att förutsäga den slumpmässiga fördelningen av Si. Med hänsyn till att vissa metaboliter befinner sig under specifika förhållanden under specifika förhållanden, och andra förhållanden inte är under specifika förhållanden, och deras försvarsvärde beror på miljön, föreslog vi också en blandad försvarsmodell, där δj och Hj är fördelade i två riktningar längs Si. Ökningen i alla riktningar gör att endast vissa metabolitgrupper, som har högre försvarsvärden, kommer att öka Si särskilt mycket, medan andra kommer att ha en slumpmässig fördelning (Figur 1B).
För att testa den omdefinierade försvarsteorin som förutsägelse på informationsteorin, tog vi fram expert- (Ms) eller generalist- (Sl) växtätande larver på bladen hos Nepenthes pallens (Figur 2A). Med hjälp av MS/MS-analys hämtade vi 599 icke-redundanta MS/MS-spektra (datafil S1) från metanolextrakt av bladvävnad insamlad efter att larverna ätit. Genom att använda RDPI-, Hj- och δj-index för att visualisera omkonfigurationen av informationsinnehåll i MS/MS-konfigurationsfiler avslöjas intressanta mönster (Figur 2B). Den övergripande trenden är att, som beskrivs av informationsdeskriptorn, allt eftersom larverna fortsätter att äta löv, ökar graden av all metabolisk omorganisation över tid: 72 timmar efter att växtätaren ätit ökar RDPI signifikant. Jämfört med den oskadade kontrollen minskade Hj signifikant, vilket berodde på den ökade graden av specialisering av den metaboliska profilen, vilken kvantifierades med δj-indexet. Denna skenbara trend överensstämmer med förutsägelserna i OD-teorin, men är inkonsekvent med de huvudsakliga förutsägelserna i MT-teorin, som anser att slumpmässiga (icke-riktade) förändringar i metabolitnivåer används som ett defensivt kamouflage (Figur 1B). Även om innehållet av oral sekretions (OS) och födointagsbeteendet hos dessa två växtätare är olika, resulterade deras direkta födointag i liknande förändringar i riktningarna för Hj och δj under 24-timmars- och 72-timmars skördeperioder. Den enda skillnaden inträffade vid 72 timmars RDPI. Jämfört med den som orsakades av Ms-utfodring var den totala metabolismen som inducerades av Sl-utfodring högre.
(A) Experimentell design: växtätare av svintyp (S1) eller experttyp (Ms) utfodras med avsaltade blad från kannaväxter, medan för simulerad växtätning används överlevnadsgraden (OS) för Ms (W + OSM) för att hantera punktering av standardiserade bladpositioner i sår. S1-larver (W + OSSl) eller vattenlarver (W + W). Kontrollgruppen (C) är ett oskadat blad. (B) Inducerbarhetsindex (RDPI jämfört med kontrolldiagrammet), diversitetsindex (Hj-index) och specialiseringsindex (δj-index) beräknat för den speciella metabolitkartan (599 MS/MS; datafil S1). Asterisker indikerar signifikanta skillnader mellan direkt växtätarutfodring och kontrollgruppen (Student's t-test med parat t-test, *P < 0,05 och ***P < 0,001). ns, inte viktiga. (C) Tidsupplösningsindex för huvudspektrumet (blå ruta, aminosyra, organisk syra och socker; datafil S2) och specialmetabolitspektrumet (röd ruta 443 MS/MS; datafil S1) efter simulerad växtätande behandling. Färgbandet hänvisar till 95 % konfidensintervall. Asterisken indikerar den signifikanta skillnaden mellan behandlingen och kontrollen [kvadratisk variansanalys (ANOVA), följt av Tukeys honestly significant difference (HSD) för post hoc multipla jämförelser, *P < 0,05, **P < 0,01 och *** P < 0,001]. (D) Specialisering av spridningsdiagram och specialmetabolitprofiler (upprepade prover med olika behandlingar).
För att undersöka om den herbivorinducerade ombyggnaden på metabolomnivå återspeglas i förändringarna i nivån av individuella metaboliter, fokuserade vi först på de metaboliter som tidigare studerats i bladen hos Nepenthes pallens med bevisad herbivorresistens. Fenoliska amider är hydroxicinnamamid-polyaminkonjugat som ackumuleras under insekternas herbivoriska process och är kända för att minska insekternas prestanda (32). Vi sökte efter prekursorer till motsvarande MS/MS och ritade deras kumulativa kinetiska kurvor (Figur S1). Inte överraskande är fenolderivat som inte är direkt involverade i försvaret mot herbivorer, såsom klorogensyra (CGA) och rutin, nedreglerade efter herbivorisk administrering. Däremot kan herbivorer göra fenolamider mycket potenta. Kontinuerlig utfodring av de två herbivorerna resulterade i nästan samma excitationsspektrum av fenolamider, och detta mönster var särskilt tydligt för de novo-syntes av fenolamider. Samma fenomen kommer att observeras när man utforskar 17-hydroxygeranylnonandiol-diterpenglykosider (17-HGL-DTG)-vägen, vilken producerar ett stort antal acykliska diterpener med effektiva anti-herbivorfunktioner (33), av vilka Ms-utfodring med Sl utlöste en liknande uttrycksprofil (Figur S1)).
Den möjliga nackdelen med direkta utfodringsexperiment med växtätare är skillnaden i bladkonsumtionshastighet och utfodringstid hos växtätare, vilket gör det svårt att eliminera de växtätarspecifika effekterna orsakade av sår och växtätare. För att bättre lösa växtätarens artspecificitet hos det inducerade bladmetaboliska svaret simulerade vi utfodringen av Ms- och Sl-larver genom att omedelbart applicera den nyligen insamlade OS (OSM och OSS1) på standardpunktionen W med konsekventa bladpositioner. Denna procedur kallas W + OS-behandling, och den standardiserar induktionen genom att exakt tidpunkta starten av svaret som framkallas av växtätaren utan att orsaka störande effekter av skillnader i hastighet eller mängd vävnadsförlust (Figur 2A) (34). Med hjälp av MS/MS-analys- och beräkningspipeline hämtade vi 443 MS/MS-spektra (datafil S1), vilka överlappade med de spektra som tidigare sammanställts från direkta utfodringsexperiment. Informationsteorianalysen av denna MS/MS-datauppsättning visade att omprogrammeringen av bladspecialiserade metabolomer genom simulering av växtätare visade OS-specifika induceringar (Figur 2C). I synnerhet, jämfört med OSS1-behandling, orsakade OSM en förbättring av metabolomspecialiseringen efter 4 timmar. Det är värt att notera att jämfört med den experimentella datamängden för direkt växtätande matning, visualiserades den metaboliska kinetiken i tvådimensionellt rum med hjälp av Hj och δj som koordinater och riktningen för metabolomspecialiseringen som svar på simulerad växtätarbehandling över tid ökade konsekvent (Figur 2D). Samtidigt kvantifierade vi innehållet av aminosyror, organiska syror och sockerarter (datafil S2) för att undersöka om denna riktade ökning av metabolomexpertis beror på omkonfigureringen av central kolmetabolism som svar på simulerade växtätare (Figur S2). För att bättre förklara detta mönster övervakade vi ytterligare den metaboliska ackumuleringskinetiken för de tidigare diskuterade fenolamid- och 17-HGL-DTG-vägarna. Den OS-specifika induktionen hos växtätare omvandlas till ett differentiellt omlagringsmönster inom fenolamidmetabolismen (Figur S3). Fenoliska amider innehållande kumarin- och koffeoylgrupper induceras företrädesvis av OSS1, medan OSM utlöser en specifik induktion av ferulylkonjugat. För 17-HGL-DTG-vägen detekterades differentiell OS-induktion genom nedströms malonylering och dimalonyleringsprodukter (Figur S3).
Därefter studerade vi den OS-inducerade transkriptomplasticiteten med hjälp av tidskurs-mikroarray-datauppsättningen, som simulerar användningen av OSM för att behandla bladen på rosettväxtens blad hos växtätare. Provtagningskinetiken överlappar i princip den kinetik som användes i denna metabolomikstudie (35). Jämfört med metabolomrekonfigurationen där metabolisk plasticitet ökar särskilt över tid, observerar vi övergående transkriptionsutbrott i blad inducerade av Ms, där transkriptominducerbarhet (RDPI) och specialisering (δj) är vid 1. Det var en signifikant ökning av timmar och diversitet (Hj) vid denna tidpunkt, uttrycket av BMP1 minskade signifikant, följt av avslappning av transkriptomspecialiseringen (Figur S4). Metaboliska genfamiljer (såsom P450, glykosyltransferas och BAHD-acyltransferas) deltar i processen att sammansätta speciella metaboliter från strukturella enheter härledda från primär metabolism, enligt den tidigare nämnda tidiga högspecialiseringsmodellen. Som en fallstudie analyserades fenylalaninvägen. Analysen bekräftade att kärngenerna i fenolamidmetabolismen är starkt OS-inducerade hos växtätare jämfört med oattraktionerade växter, och att deras uttrycksmönster är nära sammanlänkade. Transkriptionsfaktorn MYB8 och de strukturella generna PAL1, PAL2, C4H och 4CL uppströms om denna signalväg visade tidig initiering av transkription. Acyltransferaser som spelar en roll i den slutliga sammansättningen av fenolamid, såsom AT1, DH29 och CV86, uppvisar ett förlängt uppregleringsmönster (Figur S4). Ovanstående observationer indikerar att den tidiga initieringen av transkriptomspecialisering och den senare förbättringen av metabolomikspecialisering är ett kopplat tillstånd, vilket kan bero på det synkrona regleringssystemet som initierar ett kraftfullt försvarssvar.
Omkonfigurationen i växthormonsignaleringen fungerar som ett reglerande lager som integrerar växtätande information för att omprogrammera växternas fysiologi. Efter växtätarsimuleringen mätte vi den kumulativa dynamiken hos viktiga växthormonkategorier och visualiserade det tidsmässiga samuttrycket mellan dem [Pearson-korrelationskoefficient (PCC) > 0,4] (Figur 3A). Som förväntat är växthormoner relaterade till biosyntes länkade inom växthormonsamuttrycksnätverket. Dessutom mappas metabolisk specificitet (Si-index) till detta nätverk för att belysa de växthormoner som induceras av olika behandlingar. Två huvudområden för växtätande specifikt svar ritas upp: ett är i JA-klustret, där JA (dess biologiskt aktiva form JA-Ile) och andra JA-derivat visar den högsta Si-poängen; det andra är etylen (ET). Gibberellin visade endast en måttlig ökning av växtätande specificitet, medan andra växthormoner, såsom cytokinin, auxin och abscisinsyra, hade låg induktionsspecificitet för växtätare. Jämfört med att använda enbart W + W kan amplifieringen av toppvärdet för JA-derivat genom OS-applikationen (W + OS) i princip omvandlas till en stark specifik indikator för JA. Oväntat nog är OSM och OSS1 med olika elicitorinnehåll kända för att orsaka liknande ackumulering av JA och JA-Ile. Till skillnad från OSS1 induceras OSM specifikt och starkt av OSM, medan OSS1 inte amplifierar responsen från basala sår (Figur 3B).
(A) Analys av samuttrycksnätverk baserad på PCC-beräkning av simulering av kinetik för ackumulering av växthormoner inducerade av växtätare. Noden representerar ett enda växthormon, och nodens storlek representerar Si-indexet specifikt för växthormonet mellan behandlingar. (B) Ackumulering av JA, JA-Ile och ET i blad orsakade av olika behandlingar indikerade med olika färger: aprikos, W + OSM; blå, W + OSSl; svart, W + W; grå, C (kontroll). Asterisker indikerar signifikanta skillnader mellan behandling och kontroll (tvåvägs ANOVA följt av Tukey HSD post hoc multipel jämförelse, *** P <0,001). Informationsteoretisk analys av (C)697 MS/MS (datafil S1) i JA-biosyntes och försämrat perceptionsspektrum (irAOC och irCOI1) och (D)585 MS/MS (datafil S1) i ETR1 med försämrad ET-signal. Två simulerade växtätarebehandlingar utlöste växtlinjer och kontrollplantor med tom vehikel (EV). Asterisker indikerar signifikanta skillnader mellan W+OS-behandling och oskadad kontroll (tvåvägs ANOVA följt av Tukey HSD post hoc multipel jämförelse, *P < 0,05, **P < 0,01 och ***P < 0,001). (E) Spridda grafer över spridd opposition mot specialisering. Färgerna representerar olika genetiskt modifierade stammar; symbolerna representerar olika behandlingsmetoder: triangel, W + OSS1; rektangel, W + OSM; cirkel C
Därefter använder vi en genetiskt modifierad stam av försvagad Nepenthes (irCOI1 och sETR1) i nyckelstegen i JA- och ET-biosyntesen (irAOC och irACO) och perception (irCOI1 och sETR1) för att analysera metabolismen av dessa två växthormoner på växtätare. Det relativa bidraget från omprogrammering. I överensstämmelse med tidigare experiment bekräftade vi induktionen av herbivor-OS i tomma bärarväxter (EV) (Figur 3, C till D) och den totala minskningen av Hj-index orsakat av OSM, medan δj-indexet ökade. Responsen är mer uttalad än den respons som utlöses av OSS1. Ett tvålinjersdiagram med Hj och δj som koordinater visar den specifika avregleringen (Figur 3E). Den mest uppenbara trenden är att i stammar som saknar JA-signal elimineras metabolomdiversiteten och specialiseringsförändringarna orsakade av växtätare nästan helt (Figur 3C). Däremot dämpar den tysta ET-uppfattningen i sETR1-växter, även om den totala effekten på förändringar i växtätande metabolism är mycket lägre än den för JA-signalering, skillnaden i Hj- och δj-index mellan OSM- och OSS1-excitationer (Figur 3D och Figur S5). Detta indikerar att utöver kärnfunktionen för JA-signaltransduktion, fungerar ET-signaltransduktion också som en finjustering av det artsspecifika metaboliska svaret hos växtätare. I överensstämmelse med denna finjusteringsfunktion skedde ingen förändring i den totala metabolominducerbarheten i sETR1-växter. Å andra sidan, jämfört med sETR1-växter, inducerade irACO-växter liknande totala amplituder av metaboliska förändringar orsakade av växtätare, men uppvisade signifikant olika Hj- och δj-poäng mellan OSM- och OSS1-utmaningar (Figur S5).
För att identifiera specialiserade metaboliter som har viktiga bidrag till den artspecifika responsen hos växtätare och finjustera deras produktion genom ET-signaler, använde vi den tidigare utvecklade strukturella MS/MS-metoden. Denna metod bygger på bi-klustringsmetoden för att återinferera den metaboliska familjen från MS/MS-fragment [normaliserad punktprodukt (NDP)] och likhetspoäng baserat på neutral förlust (NL). MS/MS-datauppsättningen som konstruerats genom analys av ET-transgena linjer producerade 585 MS/MS (datafil S1), vilket upplöstes genom att klustra dem i sju huvudsakliga MS/MS-moduler (M) (Figur 4A). Några av dessa moduler är tätt packade med tidigare karakteriserade speciella metaboliter: till exempel är M1, M2, M3, M4 och M7 rika på olika fenolderivat (M1), flavonoidglykosider (M2), acylsockerarter (M3 och M4) och 17-HGL-DTG (M7). Dessutom beräknas den metaboliska specifika informationen (Si-index) för en enskild metabolit i varje modul, och dess Si-fördelning kan ses intuitivt. Kort sagt, MS/MS-spektra som uppvisar hög herbivorisk och genotypspecificitet kännetecknas av höga Si-värden, och kurtosstatistik indikerar fördelningen av päls i högra svanshörnet. En sådan mager kolloidfördelning detekterades i M1, där fenolamid uppvisade den högsta Si-fraktionen (Figur 4B). Den tidigare nämnda herbivoröst inducerbara 17-HGL-DTG i M7 visade en måttlig Si-poäng, vilket indikerar en måttlig grad av differentiell reglering mellan de två OS-typerna. Däremot är de flesta konstitutivt producerade specialiserade metaboliterna, såsom rutin, CGA och acylsockerarter, bland de lägsta Si-poängen. För att bättre utforska den strukturella komplexiteten och Si-fördelningen mellan speciella metaboliter konstruerades ett molekylärt nätverk för varje modul (Figur 4B). En viktig förutsägelse för OD-teorin (sammanfattad i figur 1B) är att omorganisationen av speciella metaboliter efter växtätande bör leda till envägsförändringar i metaboliter med högt försvarsvärde, särskilt genom att öka deras specificitet (i motsats till slumpmässig fördelning) Defensiv metabolit förutsägd av MT-teorin. De flesta fenolderivat som ackumuleras i M1 är funktionellt relaterade till nedgången i insekternas prestanda (32). När vi jämförde Si-värdena i M1-metaboliterna mellan de inducerade bladen och de ingående bladen i EV-kontrollplantorna efter 24 timmar observerade vi att den metaboliska specificiteten hos många metaboliter efter växtätande insekter har en signifikant ökande trend (figur 4C). Den specifika ökningen av Si-värdet detekterades endast i defensiva fenolamider, men ingen ökning av Si-värdet detekterades i andra fenoler och okända metaboliter som samexisterar i denna modul. Detta är en specialiserad modell som är relaterad till OD-teorin. De viktigaste förutsägelserna om metaboliska förändringar orsakade av växtätare är konsekventa. För att testa om denna särdrag hos fenolamidspektrumet inducerades av OS-specifik ET, plottade vi metaboliten Si-index och orsakade ett differentiellt uttrycksvärde mellan OSM och OSS1 i EV- och sETR1-genotyperna (Figur 4D). I sETR1 minskade den fenamidinducerade skillnaden mellan OSM och OSS1 kraftigt. Bi-klustringsmetoden tillämpades också på MS/MS-data insamlade i stammar med otillräcklig JA för att härleda de huvudsakliga MS/MS-modulerna relaterade till JA-reglerad metabolisk specialisering (Figur S6).
(A) Klusterresultaten för 585 MS/MS baserat på delat fragment (NDP-likhet) och delad neutral förlust (NL-likhet) resulterar i att modulen (M) är förenlig med den kända föreningsfamiljen, eller genom okänd eller dåligt metaboliserad metabolitsammansättning. Bredvid varje modul visas den metabolitspecifika (MS/MS) distributionen (Si). (B) Modulärt molekylärt nätverk: Noder representerar MS/MS och kanter, NDP (röd) och NL (blå) MS/MS-poäng (gränsvärde, > 0,6). Det graderade metabolitspecificitetsindexet (Si) färgat baserat på modulen (vänster) och mappat till det molekylära nätverket (höger). (C) Modul M1 av EV-växt i konstitutivt (kontroll) och inducerat tillstånd (simulerad växtätare) efter 24 timmar: molekylärt nätverksdiagram (Si-värdet är nodstorleken, defensiv fenolamid är markerad i blått). (D) M1-molekylära nätverksdiagrammet för spektrumlinjen sETR1 med försämrad EV- och ET-perception: fenolföreningen representerad av den gröna cirkelnoden och den signifikanta skillnaden (P-värde) mellan W + OSM- och W + OSS1-behandlingar som nodstorlek. CP, N-kaffeoyl-tyrosin; CS, N-kaffeoyl-spermidin; FP, N-ferulsyraester-urinsyra; FS, N-ferulyl-spermidin; CoP, N', N"-kumarolyl-tyrosin; DCS, N', N"-dikaffeoyl-spermidin; CFS, N', N"-kaffeoyl, feruloyl-spermidin; Lycium barbarum i gojibär-Son; Nick. O-AS, O-acylsocker.
Vi utökade analysen ytterligare från en enda försvagad Nepenthes-genotyp till naturliga populationer, där starka intraspecifika förändringar i växtätande JA-nivåer och specifika metabolitnivåer tidigare har beskrivits i naturliga populationer (26). Använd denna datamängd för att täcka 43 groddplasmer. Dessa groddplasmer består av 123 arter av växter från N. pallens. Dessa växter togs från frön som samlats in i olika inhemska habitat i Utah, Nevada, Arizona och Kalifornien (Figur S7), vi beräknade metabolomdiversiteten (här kallad populationsnivå) β-diversitet) och specialiseringen orsakad av OSM. I överensstämmelse med tidigare studier observerade vi ett brett spektrum av metaboliska förändringar längs Hj- och δj-axlarna, vilket indikerar att groddplasmer har signifikanta skillnader i plasticiteten i sina metaboliska svar på växtätare (Figur S7). Denna organisation påminner om tidigare observationer om det dynamiska omfånget av JA-förändringar orsakade av växtätare, och har bibehållit ett mycket högt värde i en enda population (26, 36). Genom att använda JA och JA-Ile för att testa den övergripande nivåkorrelationen mellan Hj och δj, fann vi att det finns en signifikant positiv korrelation mellan JA och metabolom β-diversitets- och specialiseringsindexet (Figur S7). Detta tyder på att den herbivorinducerade heterogeniteten i JA-induktion som detekterats på populationsnivå kan bero på viktiga metaboliska polymorfismer orsakade av selektion från insektsherbivorer.
Tidigare studier har visat att tobakstyper skiljer sig kraftigt åt i typ och relativt beroende av inducerade och konstitutiva metaboliska försvar. Man tror att dessa förändringar i anti-herbivorers signaltransduktion och försvarsförmåga regleras av insektspopulationstryck, växternas livscykel och försvarsproduktionskostnader i den nisch där en given art växer. Vi studerade konsistensen av bladmetabolomombyggnad inducerad av växtätare hos sex Nicotiana-arter som är inhemska i Nordamerika och Sydamerika. Dessa arter är nära besläktade med Nepenthes Nordamerika, nämligen Nicolas Bociflo, La, N. nicotinis, Nicotiana n. attenuated grass, Nicotiana tabacum, linjär tobak, tobak (Nicotiana spegazzinii) och tobaksbladstobak (Nicotiana obtusifolia) (Figur 5A) (37). Sex av dessa arter, inklusive den välkarakteriserade arten N. please, är ettåriga växter av petuniakladen, och obtusifolia N. är perenner av systerkladen Trigonophyllae (38). Därefter utfördes W + W, W + OSM och W + OSS1 induktion på dessa sju arter för att studera den metaboliska omorganiseringen av insekternas födointag på artnivå.
(A) Ett bootstrap fylogenetiskt träd baserat på maximal sannolikhet [för syntes av nukleär glutamin (38)] och den geografiska fördelningen av sju närbesläktade Nicotiana-arter (olika färger) (37). (B) Ett spridningsdiagram över specialiserad mångfald för de metaboliska profilerna för sju Nicotiana-arter (939 MS/MS; datafil S1). På artnivå är metabolomdiversiteten negativt korrelerad med graden av specialisering. Analysen av korrelationen på artnivå mellan metabolisk mångfald och specialisering och JA-ackumulering visas i figur 2. S9. Färg, olika typer; triangel, W + OSS1; rektangel, W + OSM; (C) Nicotiana JA- och JA-Ile-dynamik rankas enligt OS-excitationsamplitud (tvåvägs ANOVA och Tukey HSD efter multipel jämförelse, * P <0,05, ** P <0,01 och * ** För jämförelse av W + OS och W + W, P <0,001). Boxdiagram över (D) mångfald och (E) specialisering av varje art efter simulering av växtätande och metyl-JA (MeJA). Asterisken indikerar den signifikanta skillnaden mellan W + OS och W + W eller lanolin plus W (Lan + W) eller Lan plus MeJA (Lan + MeJa) och Lan-kontroll (tvåvägs variansanalys, följt av Tukeys HSD post hoc multipel jämförelse, *P <0,05, **P <0,01 och ***P <0,001).
Med hjälp av den dubbla klustermetoden identifierade vi 9 moduler med 939 MS/MS (datafil S1). Sammansättningen av MS/MS omkonfigurerade genom olika behandlingar varierar kraftigt mellan olika moduler och arter (Figur S8). Visualisering av Hj (här kallad γ-diversitet på artnivå) och δj visar att olika arter aggregerar till mycket olika grupper inom det metaboliska utrymmet, där artnivåindelning vanligtvis är mer framträdande än excitation. Med undantag för N. linear och N. obliquus uppvisar de ett brett dynamiskt omfång av induktionseffekter (Figur 5B). Däremot har arter som N. purpurea och N. obtusifolia ett mindre uppenbart metaboliskt svar på behandling, men metabolomet är mer diversifierat. Den artspecifika fördelningen av det inducerade metaboliska svaret resulterade i en signifikant negativ korrelation mellan specialisering och gammadiversitet (PCC = -0,46, P = 4,9×10⁻⁶). OS-inducerade förändringar i JA-nivåer är positivt korrelerade med metabolomspecialisering och negativt korrelerade med den metaboliska gammadiversiteten som varje art uppvisar (Figur 5B och Figur S9). Det är värt att notera att de arter som i dagligt tal kallas "signalrespons"-arter i Figur 5C, såsom Nepenthes nematoder, Nepenthes nepenthes, Nepenthes acute och Nepenthes attenuated, orsakade signifikanta tecken vid 30 minuter. De senaste OS-specifika JA- och JA-Ile-utbrotten, medan andra bakterier som kallas "signal-icke-responsiva", såsom Nepenthes mills, Nepenthes powdery och N. obtusifolia, endast uppvisar JA-Ile Edge-induktion utan någon OS-specificitet (Figur 5C). På metabolisk nivå, som nämnts ovan, för försvagad Nepenthes, visade de signalresponsiva substanserna OS-specificitet och ökade δj signifikant, samtidigt som de minskade Hj. Denna OS-specifika initieringseffekt detekterades inte hos arter klassificerade som signal-icke-reaktiva arter (Figur 5, D och E). OS-specifika metaboliter delas oftare mellan signalresponsiva arter, och dessa signalkluster klusterar med arter med svagare signalsvar, medan arter med svagare signalsvar uppvisar mindre ömsesidigt beroende (Figur S8). Detta resultat indikerar att den OS-specifika induktionen av JA och den OS-specifika rekonfigurationen av nedströmsmetabolomet är kopplade på artsnivå.
Därefter använde vi en lanolinpasta innehållande metyl JA (MeJA) för att behandla växter för att undersöka om dessa kopplingsmetoder begränsas av tillgången på JA applicerat av exogent JA, vilket kommer att finnas i växternas cytoplasma. Snabb avesterifiering är JA. Vi fann samma trend av den gradvisa förändringen från signalresponsiva arter till signalicke-responsiva arter orsakad av kontinuerlig tillförsel av JA (Figur 5, D och E). Kort sagt, MeJA-behandling omprogrammerade kraftigt metabolomen hos linjära nematoder, N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens och N. mikimotoi, vilket resulterade i en signifikant ökning av δj och en minskning av Hj. N. purpurea visade endast en ökning av δj, men inte Hj. N. obtusifolia, som tidigare har visat sig ackumulera extremt låga nivåer av JA, svarar också dåligt på MeJA-behandling när det gäller metabolomkonfiguration. Dessa resultat indikerar att JA-produktion eller signaltransduktion är fysiologiskt begränsad hos signalicke-responsiva arter. För att testa denna hypotes studerade vi de fyra arterna (N. pallens, N. mills, N. pink och N. microphylla) inducerade av W + W, W + OSM och W + OSS1 transkriptom (39). I överensstämmelse med mönstret för metabolomombyggnad är arterna väl separerade i transkriptomutrymmet, bland vilka N. attenuated uppvisade den högsta OS-inducerade RDPI, medan N. gracilis hade den lägsta (Figur 6A). Det visade sig dock att transkriptomdiversiteten inducerad av N. oblonga var den lägsta bland de fyra arterna, i motsats till den högsta metabonomiska diversiteten hos N. oblonga som tidigare visats hos sju arter. Tidigare studier har visat att en uppsättning gener relaterade till tidiga försvarssignaler, inklusive JA-signaler, förklarar specificiteten hos tidiga försvarssvar inducerade av herbivorrelaterade elicitorer hos Nicotiana-arter (39). Jämförelse av JA-signalvägarna mellan dessa fyra arter avslöjade ett intressant mönster (Figur 6B). De flesta gener i denna signalväg, såsom AOC, OPR3, ACX och COI1, uppvisade relativt höga induktionsnivåer hos dessa fyra arter. Emellertid omvandlar en nyckelgen, JAR4, JA till dess biologiskt aktiva form av JA-Ile-ackumulerade transkript, och dess transkriptionsnivå är mycket låg, särskilt i N. mills, Nepenthes pieris och N. microphylla. Dessutom detekterades endast transkriptet av en annan gen AOS inte i N. bifidum. Dessa förändringar i genuttryck kan vara ansvariga för de extrema fenotyper som induceras av den låga JA-produktionen hos signal-anerga arter och induktionen av N. gracilis.
(A) Informationsteoretisk analys av omprogrammering av tidiga transkriptionsresponser hos fyra närbesläktade tobaksarter samplade 30 minuter efter herbivorinduktion. RDPI beräknas genom att jämföra bladen inducerade av herbivorens OS med sårkontrollen. Färgerna indikerar olika arter och symbolerna indikerar olika behandlingsmetoder. (B) Analys av genuttryck i JA-signalvägar bland fyra arter. Den förenklade JA-vägen visas bredvid boxplottet. Olika färger indikerar olika bearbetningsmetoder. Asterisken indikerar att det finns en signifikant skillnad mellan W + OS-behandlingen och W + W-kontrollen (för Student's t-test för parvisa skillnader, *P < 0,05, **P < 0,01 och ***P < 0,001). OPDA, 12-oxofytodiensyra; OPC-8: 0,3-oxo-2(2′(Z)-pentenyl)-cyklopentan-1-oktansyra.
I den sista delen studerade vi hur insektsartspecifik ombyggnad av metabolomet hos olika växtarter kan vara resistent mot växtätare. Tidigare forskning har betonat Nicotiana-släktet. Deras resistens mot Ms och larver skiljer sig kraftigt åt (40). Här studerade vi sambandet mellan denna modell och deras metaboliska plasticitet. Genom att använda ovanstående fyra tobaksarter och testa korrelationen mellan mångfalden och specialiseringen av metabolomet orsakad av växtätare och växters resistens mot Ms och Sl, fann vi att resistens, mångfald och specialisering mot generalisten Sl är positivt korrelerade, medan korrelationen mellan resistens mot experter och specialisering är svag, och korrelationen med mångfald är inte signifikant (Figur S10). När det gäller S1-resistens hade både den försvagade N. chinensis och N. gracilis, som tidigare visat sig uppvisa både JA-signaltransduktionsnivåer och metabolomplasticitet, kraftigt olika svar på växtätarinduktion, och de uppvisade också liknande hög resistens.
Under de senaste sextio åren har växtförsvarsteorin utgjort ett teoretiskt ramverk, baserat på vilket forskare har förutspått ett betydande antal evolutioner och funktioner hos växtspecialiserade metaboliter. De flesta av dessa teorier följer inte den normala proceduren med starka slutsatser (41). De föreslår viktiga förutsägelser (3) på samma analysnivå. När testningen av viktiga förutsägelser tillåter analyser av specifika teorier kommer detta att göra att Fältet går framåt. Stöds, men förkastar andra (42). Istället gör den nya teorin förutsägelser på olika analysnivåer och lägger till ett nytt lager av beskrivande överväganden (42). De två teorierna som föreslås på funktionell nivå, MT och OD, kan dock lätt förklaras som viktiga förutsägelser av specialiserade metaboliska förändringar orsakade av växtätare: OD-teorin menar att förändringar i specialiserat metaboliskt "utrymme" är mycket riktade. MT-teorin menar att dessa förändringar kommer att vara icke-riktade och slumpmässigt placerade i det metaboliska utrymmet, och tenderar att ha metaboliter med högt försvarsvärde. Tidigare undersökningar av OD- och MT-förutsägelser har testats med hjälp av en smal uppsättning a priori "försvars"-föreningar. Dessa metabolitcentrerade tester utesluter möjligheten att analysera omfattningen och banan för metabolomrekonfiguration under växtätning, och tillåter inte testning inom ett konsekvent statistiskt ramverk för att kräva nyckelprognoser som kan betraktas som en helhet för att kvantifiera förändringar i växtmetabolom. Här använde vi den innovativa tekniken inom metabolomik baserad på beräkningsmässig MS och utförde dekonvolutionell MS-analys med den allmänna informationsteorins deskriptorer för att testa skillnaden mellan de två som föreslagits på global metabolomiknivå. Den viktigaste förutsägelsen för denna teori. Informationsteori har tillämpats inom många områden, särskilt i samband med forskning om biologisk mångfald och näringsflöde (43). Men så vitt vi vet är detta den första tillämpningen som används för att beskriva växters metaboliska informationsutrymme och lösa ekologiska problem relaterade till tillfälliga metaboliska förändringar som svar på miljösignaler. I synnerhet ligger denna metods förmåga i dess förmåga att jämföra mönster inom och mellan växtarter för att undersöka hur växtätare har utvecklats från olika arter till makroevolutionära mönster mellan arter på olika evolutionsnivåer. Metabolism.
Principalkomponentanalys (PCA) omvandlar en multivariat datamängd till ett dimensionalitetsreduktionsutrymme så att datas huvudtrenden kan förklaras. Därför används den vanligtvis som en utforskande teknik för att analysera datamängden, såsom dekonvolutionsmetabolomer. Dimensionalitetsreduktion kommer dock att förlora en del av informationsinnehållet i datamängden, och PCA kan inte ge kvantitativ information om egenskaper som är särskilt relevanta för ekologisk teori, såsom: hur växtätare omkonfigurerar mångfald inom specialiserade områden (till exempel rikedom, distribution och abundans) metaboliter? Vilka metaboliter är prediktorer för det inducerade tillståndet hos en given växtätare? Ur specificitets-, mångfalds- och inducerbarhetsperspektivet bryts informationsinnehållet i den bladspecifika metabolitprofilen ner, och det visar sig att växtätares ätande kan aktivera specifik metabolism. Oväntat observerade vi att, som beskrivs i de implementerade informationsteoriindikatorerna, den resulterande metaboliska situationen har en stor överlappning efter attackerna från de två växtätarna (den nattmatade generalisten Sl) och Solanaceae-experten Ms. Även om deras ätbeteende och koncentration skiljer sig signifikant. Fettsyra-aminosyrakonjugat (FAC)-initiator i OS (31). Genom att använda växtätande OS för att behandla standardiserade sticksår ​​visade simulerad växtätarbehandling också en liknande trend. Denna standardiserade procedur för att simulera växters svar på växtätarattacker eliminerar de störande faktorer som orsakas av förändringar i växtätarnas ätbeteende, vilket leder till varierande grader av skada vid olika tidpunkter (34). FAC, som är känd för att vara den främsta orsaken till OSM, minskar JAS och andra växthormonsvar i OSS1, medan OSS1 minskar hundratals gånger (31). OSS1 orsakade dock liknande nivåer av JA-ackumulering jämfört med OSM. Det har tidigare visats att JA-responsen i försvagade Nepenthes är mycket känslig för OSM, där FAC kan bibehålla sin aktivitet även om den späds 1:1000 med vatten (44). Jämfört med OSM är FAC i OSS1, även om den är mycket låg, tillräckligt för att inducera tillräckligt JA-utbrott. Tidigare studier har visat att porinliknande proteiner (45) och oligosackarider (46) kan användas som molekylära ledtrådar för att utlösa växtförsvarssvar i OSS1. Det är dock fortfarande oklart om dessa elicitorer i OSS1 är ansvariga för den ackumulering av JA som observerats i den aktuella studien.
Även om det finns få studier som beskriver de differentiella metaboliska fingeravtrycken som orsakas av applicering av olika växtätare eller exogena JA eller SA (salicylsyra) (47), har ingen stört den växtätande artsspecifika störningen i växtgräsnätverket och dess effekter på den specifika personliga informationen. Den övergripande effekten av metabolism studeras systematiskt. Denna analys bekräftade vidare att det interna hormonnätverkets koppling till andra växthormoner än JA formar specificiteten hos den metaboliska omorganisationen som orsakas av växtätare. I synnerhet upptäckte vi att ET orsakad av OSM var signifikant större än den som orsakades av OSS1. Detta läge överensstämmer med mer FAC-innehåll i OSM, vilket är ett nödvändigt och tillräckligt villkor för att utlösa en ET-utbrott (48). I samband med interaktionen mellan växter och växtätare är ET:s signalfunktion på växtspecifik metabolitdynamik fortfarande sporadisk och riktar sig endast mot en enda föreninggrupp. Dessutom har de flesta studier använt exogen applicering av ET eller dess prekursorer eller olika hämmare för att studera regleringen av ET, bland vilka dessa exogena kemiska tillämpningar kommer att producera många icke-specifika biverkningar. Såvitt vi vet representerar denna studie den första storskaliga systematiska undersökningen av ET:s roll i användningen av ET för att producera och uppfatta försämrad transgena växter för att koordinera växtmetabolomdynamiken. Herbivorspecifik ET-induktion kan i slutändan modulera metabolomsvaret. Den viktigaste är den transgena manipulationen av ET-biosyntes (ACO) och perceptionsgener (ETR1) som avslöjade den herbivorspecifika de novo-ackumuleringen av fenolamider. Det har tidigare visats att ET kan finjustera JA-inducerad nikotinackumulering genom att reglera putrescin-N-metyltransferas (49). Ur mekanisk synvinkel är det dock inte klart hur ET finjusterar induktionen av fenamid. Förutom ET:s signaltransduktionsfunktion kan det metaboliska flödet också shuntas till S-adenosyl-1-metionin för att reglera investeringen i polyaminofenolamider. S-adenosyl-1-metionin är ET och en vanlig intermediär i polyaminbiosyntetiska vägar. Mekanismen genom vilken ET-signalen reglerar nivån av fenolamid behöver studeras ytterligare.
På grund av det stora antalet speciella metaboliter med okänd struktur har den intensiva uppmärksamheten på specifika metaboliska kategorier länge inte kunnat strikt bedöma de tidsmässiga förändringarna av metabolisk mångfald efter biologiska interaktioner. För närvarande, baserat på informationsteoretisk analys, är det huvudsakliga resultatet av MS/MS-spektrumförvärv baserat på opartiska metaboliter att växtätare som äter eller simulerar växtätare fortsätter att minska den totala metaboliska mångfalden hos bladmetabolomet samtidigt som de ökar dess specialiseringsgrad. Denna tillfälliga ökning av metabolomspecificitet orsakad av växtätare är förknippad med en synergistisk ökning av transkriptomspecificitet. Den egenskap som bidrar mest till denna större metabolomspecialisering (med ett högre Si-värde) är den speciella metaboliten med den tidigare karakteriserade växtätande funktionen. Denna modell överensstämmer med förutsägelsen i OD-teorin, men förutsägelsen av MT relaterad till slumpmässigheten i metabolomomprogrammering är inte konsekvent. Dessa data överensstämmer dock också med förutsägelsen i den blandade modellen (bästa MT; figur 1B), eftersom andra okarakteriserade metaboliter med okända försvarsfunktioner fortfarande kan följa en slumpmässig Si-fördelning.
Ett anmärkningsvärt mönster som ytterligare fångas av denna forskning är att från mikroevolutionsnivån (enstaka växter och tobakspopulationer) till en större evolutionär skala (närbesläktade tobaksarter) är olika nivåer av evolutionär organisation i "bästa försvar". Det finns betydande skillnader i växtätarnas förmågor. Moore et al. (20) och Kessler och Kalske (1) föreslog oberoende av varandra att omvandla de tre funktionella nivåerna av biologisk mångfald som ursprungligen urskiljdes av Whittaker (50) till de konstitutiva och inducerade tidsmässiga förändringarna av kemisk mångfald; dessa författare sammanfattade inte heller. Förfarandena för storskalig metabolomdatainsamling beskriver inte heller hur man beräknar metabolisk mångfald från dessa data. I denna studie kommer mindre justeringar av Whittakers funktionella klassificering att betrakta α-metabolisk mångfald som mångfalden av MS/MS-spektra i en given växt, och β-metabolisk mångfald som den grundläggande intraspecifika metabolismen hos en grupp populationer. Rymd, och γ-metabolisk mångfald kommer att vara en förlängning av analysen av liknande arter.
JA-signalen är avgörande för ett brett spektrum av växtätande metaboliska svar. Det saknas dock rigorösa kvantitativa tester av bidraget från intraspecifik reglering av JA-biosyntes till metabolomdiversitet, och huruvida JA-signalen är en generell plats för stressinducerad metabolisk diversifiering på en högre makroevolutionär skala är fortfarande svårfångat. Vi observerade att den växtätande naturen hos Nepenthes herbivorous inducerar metabolomspecialisering och att variationen i metabolomspecialisering inom populationen av Nicotiana-arter och bland närbesläktade Nicotiana-arter är systematiskt positivt korrelerad med JA-signalering. Dessutom, när JA-signalen försämras, kommer den metaboliska specificiteten som induceras av en enda genotypväxtätare att upphävas (Figur 3, C och E). Eftersom förändringarna i metaboliskt spektrum hos de naturligt försvagade Nepenthes-populationerna mestadels är kvantitativa, kan förändringarna i den metaboliska β-diversiteten och specificiteten i denna analys till stor del orsakas av den starka excitationen av metabolitrika föreningskategorier. Dessa föreningsklasser dominerar en del av metabolomprofilen och leder till en positiv korrelation med JA-signaler.
Eftersom de biokemiska mekanismerna hos den tobaksart som är nära besläktad med den är mycket olika, identifieras metaboliterna specifikt i den kvalitativa aspekten, så den är mer analytisk. Informationsteorins bearbetning av den infångade metaboliska profilen avslöjar att växtätande induktion förvärrar avvägningen mellan metabolisk gammadiversitet och specialisering. JA-signalen spelar en central roll i denna avvägning. Ökningen av metabolomspecialisering överensstämmer med den huvudsakliga OD-prediktionen och är positivt korrelerad med JA-signalen, medan JA-signalen är negativt korrelerad med metabolisk gammadiversitet. Dessa modeller indikerar att växters OD-kapacitet huvudsakligen bestäms av JA:s plasticitet, oavsett om det är på en mikroevolutionär skala eller på en större evolutionär skala. Exogena JA-tillämpningsexperiment som kringgår JA-biosyntesdefekter avslöjar vidare att närbesläktade tobaksarter kan särskiljas i signalresponsiva och signalicke-responsiva arter, precis som deras JA-läge och metabolomplasticitet inducerad av växtätare. Signalicke-responsiva arter kan inte reagera på grund av deras oförmåga att producera endogen JA och är därför föremål för fysiologiska begränsningar. Detta kan orsakas av mutationer i vissa viktiga gener i JA-signalvägen (AOS och JAR4 i N. crescens). Detta resultat belyser att dessa makroevolutionära mönster mellan arter huvudsakligen kan drivas av förändringar i intern hormonuppfattning och responsivitet.
Förutom interaktionen mellan växter och växtätare är utforskandet av metabolisk mångfald relaterat till alla viktiga teoretiska framsteg inom forskningen om biologisk anpassning till miljön och utvecklingen av komplexa fenotypiska egenskaper. Med ökningen av mängden data som samlas in av moderna MS-instrument kan hypotesprövning om metabolisk mångfald nu överskrida individuella/kategoriskaliga metabolitskillnader och utföra global analys för att avslöja oväntade mönster. I processen med storskalig analys är en viktig metafor idén att utforma meningsfulla kartor som kan användas för att utforska data. Därför är ett viktigt resultat av den nuvarande kombinationen av opartisk MS/MS-metabolomik och informationsteori att den ger en enkel metrik som kan användas för att konstruera kartor för att bläddra bland den metaboliska mångfalden på olika taxonomiska skalor. Det är det grundläggande kravet för denna metod. Studiet av mikro-/makroevolution och samhällsekologi.
På makroevolutionär nivå är kärnan i Ehrlich och Ravens (51) teori om samevolution mellan växter och insekter att förutsäga att variationen i metabolisk mångfald mellan arter är orsaken till diversifieringen av växtlinjer. Men under de femtio år som gått sedan publiceringen av detta banbrytande verk har denna hypotes sällan testats (52). Detta beror till stor del på de fylogenetiska egenskaperna hos jämförbara metaboliska egenskaper över långdistansväxtlinjer. Sällsyntheten kan användas för att förankra målanalysmetoder. Det nuvarande MS/MS-arbetsflödet som bearbetas av informationsteori kvantifierar den strukturella MS/MS-likheten hos okända metaboliter (utan föregående metabolitval) och omvandlar dessa MS/MS till en uppsättning MS/MS, vilket innebär att inom professionell metabolism jämförs dessa makroevolutionära modeller i klassificeringsskala. Enkla statistiska indikatorer. Processen liknar fylogenetisk analys, som kan använda sekvensjustering för att kvantifiera diversifieringshastigheten eller karaktärsutvecklingen utan föregående förutsägelse.
På biokemisk nivå visar screeninghypotesen från Firn och Jones (53) att metabolisk mångfald bibehålls på olika nivåer för att tillhandahålla råmaterial för att utöva de biologiska aktiviteterna hos tidigare orelaterade eller substituerade metaboliter. Informationsteoretiska metoder tillhandahåller ett ramverk inom vilket dessa metabolitspecifika evolutionära övergångar som sker under metabolitspecialisering kan kvantifieras som en del av den föreslagna evolutionära screeningprocessen: biologiskt aktiv anpassning från låg specificitet till hög specificitet Hämmade metaboliter i en given miljö.
Sammantaget utvecklades viktiga teorier om växtförsvar under molekylärbiologins tidiga dagar, och deduktiva hypotesdrivna metoder anses allmänt vara det enda sättet att nå vetenskapliga framsteg. Detta beror till stor del på de tekniska begränsningarna med att mäta hela metabolomet. Även om hypotesdrivna metoder är särskilt användbara för att välja andra kausala mekanismer, är deras förmåga att fördjupa vår förståelse av biokemiska nätverk mer begränsad än de beräkningsmetoder som för närvarande finns tillgängliga inom modern dataintensiv vetenskap. Därför ligger teorier som inte kan förutsägas långt bortom tillgängliga data, så den hypotetiska formeln/testcykeln för framsteg inom forskningsområdet kan inte avskaffas (4). Vi förutser att det beräkningsmässiga arbetsflödet för metabolomik som introduceras här kan återuppväcka intresset för de senaste (hur) och slutgiltiga (varför) frågorna om metabolisk mångfald, och bidra till en ny era av teoretiskt vägledd datavetenskap. Eran granskade de viktiga teorier som inspirerade tidigare generationer.
Direkt växtätande utfodring utförs genom att föda upp en andra instarlarv eller Sl-larv på ett enda blekfärgat kannablad från en enda rosblommande växt, med 10 plantreplikat per planta. Insektslarverna klämdes fast med klämmor, och den återstående bladvävnaden samlades in 24 och 72 timmar efter infektion och djupfrystes, och metaboliterna extraherades.
Simulera växtätande behandling på ett mycket synkroniserat sätt. Metoden går ut på att använda tygmönsterhjul för att punktera tre rader taggar på varje sida av mittribban på växtens tre fullt expanderade blad under tyggirlangens tillväxtstadium, och omedelbart applicera 1:5 utspädd Ms. Eller använd handskbehandlade fingrar för att föra in S1 OS i sticksåret. Skörda och bearbeta ett blad enligt beskrivningen ovan. Använd den tidigare beskrivna metoden för att extrahera primära metaboliter och växthormoner (54).
För exogena JA-applikationer behandlas de tre bladskaften på var och en av de sex rosenblommande plantorna av varje art med 20 μl lanolinpasta innehållande 150 μg MeJA (Lan + MeJA) och 20 μl lanolin plus sårbehandling (Lan + W), eller så används 20 μl ren lanolin som kontroll. Bladen skördades 72 timmar efter behandlingen, frystes snabbt i flytande kväve och förvarades vid -80 °C fram till användning.
Fyra transgena JA- och ET-linjer, nämligen irAOC (36), irCOI1 (55), irACO och sETR1 (48), har identifierats i vår forskargrupp. irAOC visade en stark minskning av JA- och JA-Ile-nivåer, medan irCOI1 inte var känslig för JA. Jämfört med EV ökade JA-Ile-ackumuleringen. På liknande sätt minskar irACO produktionen av ET, och jämfört med EV ökar sETR1, som är okänslig för ET, produktionen av ET.
En fotoakustisk laserspektrometer (Sensor Sense ETD-300 realtids-ET-sensor) används för att utföra icke-invasiv ET-mätning. Omedelbart efter behandlingen skars hälften av bladen av och överfördes till en 4 ml förseglad glasampull, och luftutrymmet fick ackumuleras inom 5 timmar. Under mätningen spolades varje ampull med en ström av 2 liter/timme ren luft i 8 minuter, vilken tidigare hade passerat genom en katalysator från Sensor Sense för att avlägsna CO2 och vatten.
Mikroarraydata publicerades ursprungligen i (35) och sparades i National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Comprehensive Database (accessionsnummer GSE30287). Data som motsvarar bladen orsakade av W + OSM-behandlingen och den oskadade kontrollen extraherades för denna studie. Den råa intensiteten är log2. Före statistisk analys konverterades baslinjen och normaliserades till dess 75:e percentil med hjälp av R-programvarupaketet.
De ursprungliga RNA-sekvenseringsdata (RNA-sekvenseringsdata) för Nicotiana-arter hämtades från NCBI Short Reading Archives (SRA), projektnumret är PRJNA301787, vilket rapporterades av Zhou et al. (39) och fortsätt enligt beskrivningen i (56). Rådata som bearbetats av W + W, W + OSM och W + OSS1 motsvarande Nicotiana-arter valdes ut för analys i denna studie och bearbetades på följande sätt: Först konverterades de råa RNA-sekvenseringsavläsningarna till FASTQ-format. HISAT2 konverterar FASTQ till SAM, och SAMtools konverterar SAM-filer till sorterade BAM-filer. StringTie används för att beräkna genuttryck, och dess uttrycksmetod är att det finns fragment per tusen basfragment per miljon sekvenserade transkriptionsfragment.
Acclaim-kromatografikolonnen (150 mm x 2,1 mm; partikelstorlek 2,2 μm) som användes i analysen och 4 mm x 4 mm skyddskolonnen består av samma material. Följande binära gradient används i Dionex UltiMate 3000 Ultra High Performance Liquid Chromatography (UHPLC)-systemet: 0 till 0,5 minuter, isokratisk 90 % A [avjoniserat vatten, 0,1 % (v/v) acetonitril och 0,05 % myrsyra], 10 % B (acetonitril och 0,05 % myrsyra); 0,5 till 23,5 minuter, gradientfasen är 10 % A respektive 90 % B; 23,5 till 25 minuter, isokratisk 10 % A och 90 % B. Flödeshastigheten är 400 μl/min. För alla MS-analyser, injicera kolonneluenten i en kvadrupol- och time-of-flight (qTOF)-analysator utrustad med en elektrospraykälla som arbetar i positiv joniseringsläge (kapillärspänning, 4500 V; kapillärutlopp 130 V; torktemperatur 200 °C; torkluftflöde 10 liter/min).
Utför MS/MS-fragmentanalys (nedan kallad MS/MS) som är irrelevant eller oskiljbar från data för att erhålla strukturell information om den övergripande detekterbara metaboliska profilen. Konceptet med den urskillningslösa MS/MS-metoden bygger på det faktum att kvadrupolen har ett mycket stort massisoleringsfönster [betrakta därför alla signaler för massa-till-laddningsförhållandet (m/z) som fragment]. Av denna anledning, eftersom Impact II-instrumentet inte kunde skapa en CE-lutning, utfördes flera oberoende analyser med ökade kollisionsinducerade dissociationskollisionsenergivärden (CE). Kort sagt, analysera först provet med UHPLC-elektrosprayjonisering/qTOF-MS med hjälp av enkelmasspektrometriläge (förhållanden med låg fragmentering genererade av fragmentering i källkällan), skanning från m/z 50 till 1500 vid en repetitionsfrekvens på 5 Hz. Använd kväve som kollisionsgas för MS/MS-analys och utför oberoende mätningar vid följande fyra olika kollisionsinducerade dissociationsspänningar: 20, 30, 40 och 50 eV. Genom hela mätprocessen har kvadrupolen det största massisoleringsfönstret, från m/z 50 till 1500. När den främre kroppens m/z- och isoleringsbreddexperiment är inställt på 200, aktiveras massintervallet automatiskt av instrumentets operativsystem och 0 Da. Skanna efter massfragment som i enkelmassläge. Använd natriumformiat (50 ml isopropanol, 200 μl myrsyra och 1 ml 1M NaOH-vattenlösning) för masskalibrering. Med hjälp av Brukers högprecisionskalibreringsalgoritm kalibreras datafilen efter att medelspektrumet har körts under en given tidsperiod. Använd exportfunktionen i Data Analysis v4.0-programvaran (Brook Dalton, Bremen, Tyskland) för att konvertera rådatafilerna till NetCDF-format. MS/MS-datauppsättningen har sparats i den öppna metabolomikdatabasen MetaboLights (www.ebi.ac.uk) med accessionsnumret MTBLS1471.
MS/MS-assembling kan realiseras genom korrelationsanalys mellan MS1- och MS/MS-kvalitetssignaler för låg och hög kollisionsenergi och nyligen implementerade regler. R-skriptet används för att realisera korrelationsanalysen av distributionen av föregångaren till produkten, och C#-skriptet (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline) används för att implementera reglerna.
För att minska falskt positiva fel orsakade av bakgrundsbrus och falsk korrelation orsakad av att vissa m/z-funktioner detekteras i endast ett fåtal prover, använder vi funktionen "filled peak" i R-paketet XCMS (för korrigering av bakgrundsbrus). Denna funktion bör användas för att ersätta "NA"-intensiteten (odetected peak). När fyllningstoppfunktionen används finns det fortfarande många "0"-intensitetsvärden i datamängden som kommer att påverka korrelationsberäkningen. Sedan jämför vi databehandlingsresultaten som erhållits när fyllningstoppfunktionen används och när den inte används, och beräknar bakgrundsbrusvärdet baserat på det genomsnittliga korrigerade uppskattade värdet, och ersätter sedan dessa 0-intensitetsvärden med det beräknade bakgrundsvärdet. Vi beaktade också endast funktioner vars intensitet översteg tre gånger bakgrundsvärdet och betraktade dem som "sanna toppar". För PCC-beräkningar beaktas endast m/z-signalerna från provprekursorn (MS1) och fragmentdatamängder med minst åtta sanna toppar.
Om intensiteten hos prekursorkvalitetsegenskapen i hela provet är signifikant korrelerad med den reducerade intensiteten hos samma kvalitetsegenskap som utsätts för låg eller hög kollisionsenergi, och egenskapen inte är märkt som en isotoptopp av CAMERA, kan den definieras ytterligare. Genom att sedan beräkna alla möjliga prekursor-produktpar inom 3 s (det uppskattade retentionstidsfönstret för toppretention) utförs korrelationsanalysen. Endast när m/z-värdet är lägre än prekursorvärdet och MS/MS-fragmentering sker på samma provplats i datamängden som prekursorn från vilken den härleds, betraktas den som ett fragment.
Baserat på dessa två enkla regler exkluderar vi de specificerade fragmenten med m/z-värden större än m/z för den identifierade prekursorn, och baserat på provpositionen där prekursorn förekommer och det specificerade fragmentet. Det är också möjligt att välja de kvalitetsegenskaper som genereras av många in-source-fragment genererade i MS1-läge som kandidatprekursorer, och därigenom generera redundanta MS/MS-föreningar. För att minska denna dataredundans, om NDP-likheten för spektra överstiger 0,6, och de tillhör kromatogrammet "pcgroup" som annoterats av CAMERA, kommer vi att slå samman dem. Slutligen slår vi samman alla fyra CE-resultat associerade med prekursorn och fragmenten till det slutliga dekonvolverade kompositspektrumet genom att välja toppen med högsta intensitet bland alla kandidattoppar med samma m/z-värde vid olika kollisionsenergier. De efterföljande bearbetningsstegen är baserade på konceptet med kompositspektrum och tar hänsyn till de olika CE-förhållanden som krävs för att maximera sannolikheten för fragmentering, eftersom vissa fragment endast kan detekteras under en specifik kollisionsenergi.
RDPI (30) användes för att beräkna inducerbarheten hos den metaboliska profilen. Den metaboliska spektrumdiversiteten (Hj-index) härleds från förekomsten av MS/MS-prekursorer med hjälp av Shannon-entropin för MS/MS-frekvensfördelningen med hjälp av följande ekvation beskriven av Martínez et al. (8). Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij) där Pij motsvarar den relativa frekvensen av den i:te MS/MS i det j:te provet (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2, …, m) t).
Metabolisk specificitet (Si-index) definieras som uttrycksidentiteten för en given MS/MS i förhållande till frekvensen mellan de prover som beaktas. MS/MS-specificitet beräknas som Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi)
Använd följande formel för att mäta det metabolomspecifika δj-indexet för varje j-prov och medelvärdet av MS/MS-specificiteten δj = ∑i = 1mPijSi
MS/MS-spektra justeras parvis, och likheten beräknas baserat på de två poängen. Först, med hjälp av standard NDP (även känd som cosinuskorrelationsmetod), använd följande ekvation för att poängsätta segmentlikheten mellan spektra: NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2 där S1 och S2. På motsvarande sätt, för spektrum 1 och spektrum 2, såväl som WS1, i och WS2, representerar i viktningen baserad på toppintensiteten där skillnaden mellan den i:e gemensamma toppen mellan de två spektra är mindre än 0,01 Da. Vikten beräknas enligt följande: W = [toppintensitet] m [kvalitet] n, m = 0,5, n = 2, enligt MassBank.
En andra poängsättningsmetod implementerades, vilken innebar att analysera den delade NL mellan MS/MS. För detta ändamål använde vi de 52 NL-listorna som ofta förekommer under MS-fragmenteringsprocessen tillsammans, och den mer specifika NL (datafil S1) som tidigare har annoterats för MS/MS-spektrumet för de sekundära metaboliterna hos den försvagade Nepenthes-arten (9, 26). Skapa en binär vektor med 1 och 0 för varje MS/MS, vilket motsvarar den nuvarande respektive icke-existerande av vissa NL. Baserat på den euklidiska avståndslikheten beräknas NL-likhetspoängen för varje par av binära NL-vektorer.
För att utföra dubbel klustring använde vi R-paketet DiffCoEx, vilket är baserat på en utökning av Weighted Gene Co-expression Analysis (WGCNA). Med hjälp av NDP- och NL-poängmatriserna från MS/MS-spektra använde vi DiffCoEx för att beräkna den jämförande korrelationsmatrisen. Binär klustring utförs genom att ställa in parametern "cutreeDynamic" till method = "hybrid", cutHeight = 0.9999, deepSplit = T och minClusterSize = 10. R-källkoden för DiffCoEx laddades ner från tilläggsfil 1 av Tesson et al. (57); Det nödvändiga R WGCNA-programvarupaketet finns på https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA.
För att utföra MS/MS molekylär nätverksanalys beräknade vi parad spektral konnektivitet baserat på NDP- och NL-likhetstyper och använde Cytoscape-programvara för att visualisera nätverkstopologi med hjälp av organisk layout i CyFilescape yFiles layoutalgoritmtilläggsapplikation.
Använd R version 3.0.1 för att utföra statistisk analys av data. Statistisk signifikans bedömdes med hjälp av tvåvägsvariansanalys (ANOVA), följt av Tukeys honestly significant difference (HSD) post-hoc-test. För att analysera skillnaden mellan den växtätande behandlingen och kontrollen analyserades den tvåsidiga fördelningen av de två grupperna av prover med samma varians med hjälp av Students t-test.
För kompletterande material till den här artikeln, se http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1
Detta är en artikel med öppen åtkomst som distribueras under villkoren i Creative Commons Attribution-Non-Commercial-licensen, som tillåter användning, distribution och reproduktion i vilket medium som helst, så länge den slutliga användningen inte är för kommersiell vinning och förutsättningen är att originalverket är korrekt. Referens.
Obs: Vi ber dig bara att ange din e-postadress så att personen du rekommenderar till sidan vet att du vill att de ska se e-postmeddelandet och att det inte är skräppost. Vi kommer inte att samla in några e-postadresser.
Den här frågan används för att testa om du är en besökare och förhindra automatisk spam.
Informationsteori tillhandahåller en universell valuta för jämförelse av speciella metabolomer och förutsägelse av testförsvarsteorier.
Informationsteori tillhandahåller en universell valuta för jämförelse av speciella metabolomer och förutsägelse av testförsvarsteorier.
©2021 American Association for the Advancement of Science. alla rättigheter reserverade. AAAS är partner till HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef och COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.