Artikeln är en del av forskningsämnet ”Förbättra baljväxters resistens mot patogener och skadedjur”, se alla 5 artiklar
Den orsakande svampsjukdomen nekros Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary använder en flerstegsstrategi för att infektera olika värdväxter. Denna studie föreslår användning av diaminen L-ornitin, en icke-proteinbaserad aminosyra som stimulerar syntesen av andra essentiella aminosyror, som en alternativ hanteringsstrategi för att förbättra de molekylära, fysiologiska och biokemiska svaren hos Phaseolus vulgaris L. på vitmögel orsakad av Pseudomonas sclerotiorum. In vitro-experiment visade att L-ornitin signifikant hämmade myceltillväxten av S. pyrenoidosa på ett dosberoende sätt. Dessutom kunde det avsevärt minska svårighetsgraden av vitmögel under växthusförhållanden. Dessutom stimulerade L-ornitin tillväxten hos de behandlade växterna, vilket indikerar att de testade koncentrationerna av L-ornitin inte var fytotoxiska för de behandlade växterna. Dessutom ökade L-ornitin uttrycket av icke-enzymatiska antioxidanter (totalt lösliga fenoler och flavonoider) och enzymatiska antioxidanter (katalas (CAT), peroxidas (POX) och polyfenoloxidas (PPO)) och ökade uttrycket av tre antioxidantrelaterade gener (PvCAT1, PvSOD och PvGR). Vidare avslöjade in silico-analys närvaron av ett förmodat oxaloacetatacetylhydrolas (SsOAH)-protein i S. sclerotiorum-genomet, vilket var mycket likt oxaloacetatacetylhydrolas (SsOAH)-proteinerna från Aspergillus fijiensis (AfOAH) och Penicillium sp. (PlOAH) vad gäller funktionell analys, konserverade domäner och topologi. Intressant nog minskade tillsatsen av L-ornitin till potatisdextrosbuljongmedium (PDB) uttrycket av SsOAH-genen i S. sclerotiorum-mycel signifikant. På liknande sätt minskade exogen applicering av L-ornitin signifikant uttrycket av SsOAH-genen i svampmycel insamlade från behandlade växter. Slutligen minskade L-ornitinapplicering signifikant oxalsyrasekretionen i både PDB-medium och infekterade blad. Sammanfattningsvis spelar L-ornitin en nyckelroll för att upprätthålla redoxstatus samt förbättra försvarssvaret hos infekterade växter. Resultaten av denna studie kan bidra till att utveckla innovativa, miljövänliga metoder för att bekämpa vitmögel och mildra dess inverkan på bönproduktion och andra grödor.
Vitmögel, orsakat av den nekrotrofa svampen Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, är en förödande, avkastningsreducerande sjukdom som utgör ett allvarligt hot mot den globala bönproduktionen (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum är en av de svåraste jordburna svampväxtpatogenerna att bekämpa, med ett brett värdspektrum på över 600 växtarter och förmågan att snabbt macerera värdvävnader på ett ospecifikt sätt (Liang och Rollins, 2018). Under ogynnsamma förhållanden genomgår den en kritisk fas av sin livscykel och förblir vilande under långa perioder som svarta, hårda, fröliknande strukturer som kallas "sklerotier" i jorden eller som vita, fluffiga utväxter i mycelet eller stjälkmärgen hos infekterade växter (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum kan bilda sklerotier, vilket gör att den kan överleva i infekterade fält under långa perioder och att fortsätta växa under sjukdom (Schwartz et al., 2005). Sklerotier är rika på näringsämnen, kan leva kvar i jorden under långa perioder och fungera som primärt inokulum för efterföljande infektioner (Schwartz et al., 2005). Under gynnsamma förhållanden gror sklerotier och producerar luftburna sporer som kan infektera alla ovanjordiska delar av växten, inklusive men inte begränsat till blommor, stjälkar eller baljor (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum använder en flerstegsstrategi för att infektera sina värdväxter, som involverar en serie koordinerade händelser från sklerotiell groning till symptomutveckling. Initialt producerar S. sclerotiorum suspenderade sporer (kallade askosporer) från svampliknande strukturer som kallas apotecier, vilka blir luftburna och utvecklas till icke-rörliga sklerotier på infekterade växtrester (Bolton et al., 2006). Svampen utsöndrar sedan oxalsyra, en virulensfaktor, för att kontrollera växtcellväggens pH-värde, främja enzymatisk nedbrytning och vävnadsinvasion (Hegedus och Rimmer, 2005) och undertrycka värdväxtens oxidativa utbrott. Denna försurningsprocess försvagar växtcellväggen och ger en gynnsam miljö för normal och effektiv drift av svampcellväggsnedbrytande enzymer (CWDE), vilket gör att patogenen kan övervinna den fysiska barriären och penetrera värdvävnaderna (Marciano et al., 1983). När S. sclerotiorum väl penetrerats utsöndrar den ett antal CWDE:er, såsom polygalakturonas och cellulas, vilka underlättar dess spridning i infekterade vävnader och orsakar vävnadsnekros. Utvecklingen av lesioner och hyfmattor leder till de karakteristiska symtomen på vitmögel (Hegedus och Rimmer, 2005). Samtidigt känner värdväxter igen patogenassocierade molekylära mönster (PAMP) genom mönsterigenkänningsreceptorer (PRR), vilket utlöser en serie signalhändelser som i slutändan aktiverar försvarssvar.
Trots årtionden av sjukdomsbekämpningsinsatser kvarstår bristen på tillräckligt med resistent groddplasma hos bönor, liksom hos andra kommersiella grödor, på grund av patogenens resistens, överlevnad och anpassningsförmåga. Sjukdomshantering är därför extremt utmanande och kräver en integrerad, mångfacetterad strategi som inkluderar en kombination av kulturella metoder, biologisk bekämpning och kemiska fungicider (O'Sullivan et al., 2021). Kemisk bekämpning av vitmögel är den mest effektiva eftersom fungicider, när de appliceras korrekt och vid rätt tidpunkt, effektivt kan kontrollera sjukdomens spridning, minska infektionens svårighetsgrad och minimera skördeförluster. Överanvändning och överberoende av fungicider kan dock leda till uppkomsten av resistenta stammar av S. sclerotiorum och negativt påverka icke-målorganismer, markhälsa och vattenkvalitet (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Därför har det blivit högsta prioritet att hitta miljövänliga alternativ.
Polyaminer (PA), såsom putrescin, spermidin, spermin och kadaverin, kan fungera som lovande alternativ mot jordburna växtpatogener och därigenom helt eller delvis minska användningen av farliga kemiska fungicider (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). I högre växter är PA involverade i många fysiologiska processer, inklusive, men inte begränsat till, celldelning, differentiering och respons på abiotiska och biotiska stressfaktorer (Killiny och Nehela, 2020). De kan fungera som antioxidanter, hjälpa till att fånga upp reaktiva syreradikaler (ROS), upprätthålla redoxhomeostas (Nehela och Killiny, 2023), inducera försvarsrelaterade gener (Romero et al., 2018), reglera olika metaboliska vägar (Nehela och Killiny, 2023), modulera endogena fytohormoner (Nehela och Killiny, 2019), etablera systemisk förvärvad resistens (SAR) och reglera interaktioner mellan växter och patogener (Nehela och Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Det är värt att notera att de specifika mekanismerna och rollerna för PA i växtförsvar varierar beroende på växtart, patogener och miljöförhållanden. Den vanligaste PA i växter biosyntetiseras från den essentiella polyaminen L-ornitin (Killiny och Nehela, 2020).
L-ornitin spelar flera roller i växters tillväxt och utveckling. Tidigare studier har till exempel visat att ornitin i ris (Oryza sativa) kan vara associerat med kväveåtervinning (Liu et al., 2018), risavkastning, kvalitet och arom (Lu et al., 2020) samt vattenstressrespons (Yang et al., 2000). Dessutom förbättrade exogen applicering av L-ornitin torktoleransen hos sockerbetor (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) avsevärt och lindrade saltstress hos lök- (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu och Çavuşoǧlu, 2021) och cashewnötter (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012). L-ornitins potentiella roll i försvar mot abiotisk stress kan bero på dess inblandning i prolinackumulering i behandlade växter. Till exempel har gener relaterade till prolinmetabolism, såsom ornitin delta aminotransferas (delta-OAT) och prolin dehydrogenas (ProDH1 och ProDH2) gener, tidigare rapporterats vara involverade i försvaret av Nicotiana benthamiana och Arabidopsis thaliana mot icke-värdstammar av Pseudomonas syringae (Senthil-Kumar och Mysore, 2012). Å andra sidan krävs svampens ornitin dekarboxylas (ODC) för patogentillväxt (Singh et al., 2020). Att rikta in sig på ODC hos Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici via värdinducerad gensläckning (HIGS) ökade tomatplantornas resistens mot Fusarium vissnesjuka avsevärt (Singh et al., 2020). Den potentiella rollen av exogen ornitintillförsel mot biotiska stressfaktorer såsom fytopatogener har dock inte studerats väl. Ännu viktigare är att effekterna av ornitin på sjukdomsresistens och de associerade biokemiska och fysiologiska fenomenen förblir i stort sett outforskade.
Att förstå komplexiteten hos S. sclerotiorum-infektion av baljväxter är viktigt för utvecklingen av effektiva bekämpningsstrategier. I denna studie syftade vi till att identifiera den potentiella rollen av diaminen L-ornitin som en nyckelfaktor för att förbättra försvarsmekanismerna och resistensen hos baljväxter mot Sclerotinia sclerotiorum-infektion. Vi antar att L-ornitin, förutom att förbättra försvarssvaren hos infekterade växter, också spelar en nyckelroll för att upprätthålla redoxstatusen. Vi föreslår att de potentiella effekterna av L-ornitin är relaterade till regleringen av enzymatiska och icke-enzymatiska antioxidanta försvarsmekanismer och störning av svamppatogenicitets-/virulensfaktorer och associerade proteiner. Denna dubbla funktionalitet hos L-ornitin gör det till en lovande kandidat för en hållbar strategi för att mildra effekterna av vitmögel och öka resistensen hos vanliga baljväxter mot denna potenta svamppatogen. Resultaten av den här studien kan bidra till utvecklingen av innovativa, miljövänliga metoder för att bekämpa vitmögel och mildra dess inverkan på baljväxtproduktionen.
I denna studie användes en mottaglig kommersiell sort av vanlig böna, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), som experimentmaterial. Friska frön tillhandahölls vänligen av Legume Research Department, Field Crops Research Institute (FCRI), Agricultural Research Center (ARC), Egypten. Fem frön såddes i plastkrukor (innerdiameter 35 cm, djup 50 cm) fyllda med S. sclerotiorum-infekterad jord under växthusförhållanden (25 ± 2 °C, relativ fuktighet 75 ± 1 %, 8 timmar ljus/16 timmar mörker). 7–10 dagar efter sådd (DPS) gallrades plantorna ut för att endast lämna två plantor med jämn tillväxt och tre fullt utvecklade blad i varje kruka. Alla krukväxter vattnades en gång varannan vecka och gödslades månadsvis med den rekommenderade mängden för den givna sorten.
För att framställa en koncentration på 500 mg/L av L-ornitindiamin (även känd som (+)-(S)-2,5-diaminopentansyra; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Tyskland) löstes först 50 mg i 100 ml sterilt destillerat vatten. Stamlösningen späddes sedan ut och användes i efterföljande experiment. Kortfattat testades sex serier av L-ornitinkoncentrationer (12,5, 25, 50, 75, 100 och 125 mg/L) in vitro. Dessutom användes sterilt destillerat vatten som negativ kontroll (Mock) och det kommersiella fungicidet "Rizolex-T" 50 % vätbart pulver (toklofosmetyl 20 % + tiram 30 %; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gharbia Governorate, Egypten) användes som positiv kontroll. Det kommersiella fungicidmedlet "Rizolex-T" testades in vitro vid fem koncentrationer (2, 4, 6, 8 och 10 mg/L).
Prover av vanliga bönstjälkar och baljor som uppvisade typiska symptom på vitmögel (angreppsgrad: 10–30 %) samlades in från kommersiella gårdar. Även om de flesta infekterade växtmaterialen identifierades efter art/sort (mottaglig kommersiell sort Giza 3), var andra, särskilt de som erhölls från lokala marknader, av okänd art. De insamlade infekterade materialen desinficerades först med 0,5 % natriumhypokloritlösning i 3 minuter, sköljdes sedan flera gånger med sterilt destillerat vatten och torkades torrt med sterilt filterpapper för att avlägsna överflödigt vatten. De infekterade organen skars sedan i små bitar från den mellersta vävnaden (mellan friska och infekterade vävnader), odlades på potatisdextrosagar (PDA)-medium och inkuberades vid 25 ± 2 °C med en 12 timmars ljus-/12 timmars mörkercykel i 5 dagar för att stimulera sklerotierbildning. Mycelspetsmetoden användes också för att rena svampisolat från blandade eller kontaminerade kulturer. Det renade svampisolatet identifierades först baserat på dess kulturella morfologiska egenskaper och bekräftades sedan vara S. sclerotiorum baserat på mikroskopiska egenskaper. Slutligen testades alla renade isolat för patogenicitet på den mottagliga vanliga bönsorten Giza 3 för att uppfylla Kochs postulat.
Dessutom bekräftades det mest invasiva S. sclerotiorum-isolatet (isolat #3) ytterligare baserat på intern transkriberad spacer (ITS)-sekvensering enligt beskrivningen av White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. Kortfattat odlades isolaten i potatisdextrosbuljong (PDB) och inkuberades vid 25 ± 2 °C i 5–7 dagar. Svampmycel samlades sedan in, filtrerades genom ostduk, tvättades två gånger med sterilt vatten och torkades med sterilt filterpapper. Genomiskt DNA isolerades med hjälp av Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). ITS rDNA-regionen amplifierades sedan med hjälp av det specifika primerparet ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; förväntad storlek: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). De renade PCR-produkterna skickades in för sekvensering (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). ITS rDNA-sekvenserna sekvenserades dubbelriktat med hjälp av Sanger-sekvenseringsmetoden. De sammansatta frågesekvenserna jämfördes sedan med de senaste uppgifterna i GenBank och National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) med hjälp av BLASTn-programvara. Frågesekvensen jämfördes med 20 andra S. sclerotiorum-stammar/isolat hämtade från de senaste uppgifterna i NCBI GenBank (kompletterande tabell S1) med hjälp av ClustalW i Molecular Evolutionary Genetics Analysis Package (MEGA-11; version 11) (Kumar et al., 2024). Evolutionär analys utfördes med hjälp av maximum likelihood-metoden och den allmänna tidsreversibla nukleotidsubstitutionsmodellen (Nei och Kumar, 2000). Trädet med högst log-likelihood visas. Det initiala trädet för den heuristiska sökningen väljs genom att välja trädet med högst log-likelihood mellan neighbor-joining (NJ)-trädet (Kumar et al., 2024) och maximum parsimony (MP)-trädet. NJ-trädet konstruerades med hjälp av en parvis avståndsmatris beräknad med den allmänna tidsreversibla modellen (Nei och Kumar, 2000).
Den antibakteriella aktiviteten hos L-ornitin och baktericiden "Rizolex-T" bestämdes in vitro med agardiffusionsmetoden. Metod: Ta lämplig mängd av stamlösningen av L-ornitin (500 mg/L) och blanda den noggrant med 10 ml av PDA-näringsmediet för att framställa lösningar med slutliga koncentrationer på 12,5, 25, 50, 75, 100 respektive 125 mg/L. Fem koncentrationer av fungiciden "Rizolex-T" (2, 4, 6, 8 och 10 mg/L) och sterilt destillerat vatten användes som kontroll. Efter att mediet hade stelnat överfördes en nyberedd mycelplugg av Sclerotinia sclerotiorum-kultur, 4 mm i diameter, till mitten av petriskålen och odlades vid 25 ± 2 °C tills mycelet täckte hela kontrollpetriskålen, varefter svamptillväxten registrerades. Beräkna den procentuella hämningen av radiell tillväxt av S. sclerotiorum med hjälp av ekvation 1:
Experimentet upprepades två gånger, med sex biologiska replikat för varje kontroll-/experimentgrupp och fem krukor (två plantor per kruka) för varje biologiskt replikat. Varje biologiskt replikat analyserades två gånger (två tekniska replikat) för att säkerställa de experimentella resultatens noggrannhet, tillförlitlighet och reproducerbarhet. Dessutom användes probit-regressionsanalys för att beräkna halvmaximal hämmande koncentration (IC50) och IC99 (Prentice, 1976).
För att utvärdera potentialen hos L-ornitin under växthusförhållanden utfördes två på varandra följande krukexperiment. Kortfattat fylldes krukorna med steriliserad lera-sandjord (3:1) och inokulerades med en nyberedd kultur av S. sclerotiorum. Först odlades det mest invasiva isolatet av S. sclerotiorum (isolat #3) genom att skära en sklerot i hälften, placera den med framsidan nedåt på en PDA och inkubera vid 25 °C i konstant mörker (24 timmar) i 4 dagar för att stimulera myceltillväxt. Fyra agarpluggar med 5 mm diameter togs sedan från framkanten och inokulerades med 100 g av en steril blandning av vete- och riskli (1:1, v/v) och alla kolvar inkuberades vid 25 ± 2 °C under en 12 timmars ljus/12 timmars mörkercykel i 5 dagar för att stimulera sklerotierbildning. Innehållet i alla kolvar blandades noggrant för att säkerställa homogenitet innan jord tillsattes. Därefter tillsattes 100 g av den koloniserande kliblandningen till varje kruka för att säkerställa en konstant koncentration av patogener. De inokulerade krukorna vattnades för att aktivera svamptillväxt och placerades i växthusförhållanden i 7 dagar.
Fem frön av sorten Giza 3 såddes sedan i varje kruka. För krukorna som behandlats med L-ornitin och fungiciden Rizolex-T blötlades de steriliserade fröna först i två timmar i en vattenlösning av de två föreningarna med en slutlig IC99-koncentration på cirka 250 mg/L respektive 50 mg/L, och lufttorkades sedan i en timme före sådd. Å andra sidan blötlades fröna i sterilt destillerat vatten som negativ kontroll. Efter 10 dagar, före den första vattningen, gallrades plantorna ut, så att endast två rena plantor lämnades kvar i varje kruka. För att säkerställa infektion med S. sclerotiorum skars dessutom bönplantornas stjälkar i samma utvecklingsstadium (10 dagar) av på två olika platser med en steriliserad skalpell och cirka 0,5 g av den koloniserande kliblandningen placerades i varje sår, följt av hög luftfuktighet för att stimulera infektion och sjukdomsutveckling hos alla inympade plantor. Kontrollplantorna skadades på liknande sätt och en lika stor mängd (0,5 g) steril, okoloniserad kliblandning placerades i såret och hölls under hög luftfuktighet för att simulera miljön för sjukdomsutveckling och säkerställa konsistens mellan behandlingsgrupperna.
Behandlingsmetod: Bönplantor vattnades med 500 ml av en vattenlösning av L-ornitin (250 mg/l) eller fungiciden Rizolex-T (50 mg/l) genom att bevattna jorden, därefter upprepades behandlingen tre gånger med 10 dagars intervall. De placebobehandlade kontrollerna bevattnades med 500 ml sterilt destillerat vatten. Alla behandlingar utfördes under växthusförhållanden (25 ± 2 °C, 75 ± 1 % relativ fuktighet och en fotoperiod på 8 timmar ljus/16 timmar mörker). Alla krukor vattnades varannan vecka och behandlades månadsvis med ett balanserat NPK-gödselmedel (20-20-20, med 3,6 % svavel och TE-mikroelement; Zain Seeds, Egypten) i en koncentration av 3–4 g/l genom bladbesprutning enligt rekommendationerna för den specifika sorten och tillverkarens instruktioner. Om inget annat anges samlades fullt expanderade mogna blad (2:a och 3:e bladet uppifrån) in från varje biologiskt replikat 72 timmar efter behandling (hpt), homogeniserades, poolades och förvarades vid -80 °C för vidare analyser inklusive, men inte begränsat till, in situ histokemisk lokalisering av oxidativa stressindikatorer, lipidperoxidation, enzymatiska och icke-enzymatiska antioxidanter och genuttryck.
Intensiteten av vitmögelinfektion bedömdes varje vecka 21 dagar efter inympning (dpi) med hjälp av en skala från 1–9 (kompletterande tabell S2) baserad på Petzoldt och Dicksons skala (1996) modifierad av Teran et al. (2006). Kortfattat undersöktes stjälkar och grenar på bönplantor med början vid inympningspunkten för att följa lesionernas utveckling längs internoder och noder. Avståndet från lesionen från inympningspunkten till den längsta punkten längs stammen eller grenen mättes sedan och en poäng på 1–9 tilldelades baserat på lesionens plats, där (1) indikerade ingen synlig infektion nära inympningspunkten och (2–9) indikerade en gradvis ökning av lesionens storlek och progression längs noder/internoder (kompletterande tabell S2). Intensiteten av vitmögelinfektion omvandlades sedan till procentandel med hjälp av formel 2:
Dessutom beräknades arean under sjukdomsprogressionskurvan (AUDPC) med hjälp av formeln (Shaner och Finney, 1977), som nyligen anpassades för vitröta hos vanliga bönor (Chauhan et al., 2020) med hjälp av ekvation 3:
Där Yi = sjukdomens svårighetsgrad vid tidpunkten ti, Yi+1 = sjukdomens svårighetsgrad vid nästa tidpunkt ti+1, ti = tidpunkt för första mätning (i dagar), ti+1 = tidpunkt för nästa mätning (i dagar), n = totalt antal tidpunkter eller observationspunkter. Bönväxternas tillväxtparametrar inklusive växthöjd (cm), antal grenar per planta och antal blad per planta registrerades varje vecka i 21 dagar i alla biologiska replikat.
I varje biologiskt replikat samlades bladprover (andra och tredje fullt utvecklade blad från toppen) in på dag 45 efter behandling (15 dagar efter den sista behandlingen). Varje biologiskt replikat bestod av fem krukor (två plantor per kruka). Cirka 500 mg av den krossade vävnaden användes för extraktion av fotosyntetiska pigment (klorofyll a, klorofyll b och karotenoider) med 80 % aceton vid 4 °C i mörker. Efter 24 timmar centrifugerades proverna och supernatanten samlades in för bestämning av klorofyll a, klorofyll b och karotenoidinnehåll kolorimetriskt med en UV-160A spektrofotometer (Shimadzu Corporation, Japan) enligt metoden från (Lichtenthaler, 1987) genom att mäta absorbansen vid tre olika våglängder (A470, A646 och A663 nm). Slutligen beräknades innehållet av fotosyntetiska pigment med hjälp av följande formler 4–6 beskrivna av Lichtenthaler (1987).
72 timmar efter behandling (hpt) samlades blad (andra och tredje fullt utvecklade blad från toppen) in från varje biologiskt replikat för in situ histokemisk lokalisering av väteperoxid (H2O2) och superoxidanjon (O2•−). Varje biologiskt replikat bestod av fem krukor (två plantor per kruka). Varje biologiskt replikat analyserades i duplikat (två tekniska replikat) för att säkerställa metodens noggrannhet, tillförlitlighet och reproducerbarhet. H2O2 och O2•− bestämdes med 0,1 % 3,3′-diaminobensidin (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Tyskland) respektive nitroblått tetrazolium (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Tyskland), enligt metoderna som beskrivs av Romero-Puertas et al. (2004) och Adam et al. (1989) med mindre modifieringar. För histokemisk lokalisering av H2O2 in situ vakuuminfiltrerades klaffarna med 0,1 % DAB i 10 mM Tris-buffert (pH 7,8) och inkuberades sedan vid rumstemperatur i ljus i 60 minuter. Klaffarna blektes i 0,15 % (v/v) TCA i 4:1 (v/v) etanol:kloroform (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kairo, Egypten) och exponerades sedan för ljus tills de mörknade. På liknande sätt vakuuminfiltrerades klaffar med 10 mM kaliumfosfatbuffert (pH 7,8) innehållande 0,1 w/v % HBT för histokemisk lokalisering av O2•− in situ. Klaffarna inkuberades i ljus vid rumstemperatur i 20 minuter, blektes sedan som ovan och belystes sedan tills mörkblå/violetta fläckar uppstod. Intensiteten hos den resulterande bruna (som en H2O2-indikator) eller blåvioletta (som en O2•−-indikator) färgen bedömdes med hjälp av Fiji-versionen av bildbehandlingspaketet ImageJ (http://fiji.sc; hämtad 7 mars 2024).
Malondialdehyd (MDA; som markör för lipidperoxidation) bestämdes enligt metoden av Du och Bramlage (1992) med smärre modifieringar. Blad från varje biologiskt replikat (andra och tredje fullt utvecklade blad från toppen) samlades in 72 timmar efter behandling (hpt). Varje biologiskt replikat inkluderade fem krukor (två plantor per kruka). Varje biologiskt replikat analyserades i duplikat (två tekniska replikat) för att säkerställa metodens noggrannhet, tillförlitlighet och reproducerbarhet. Kortfattat användes 0,5 g mald bladvävnad för MDA-extraktion med 20 % triklorättiksyra (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) innehållande 0,01 % butylerad hydroxitoluen (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). MDA-halten i supernatanten bestämdes sedan kolorimetriskt genom att mäta absorbansen vid 532 och 600 nm med hjälp av en UV-160A-spektrofotometer (Shimadzu Corporation, Japan) och uttrycktes sedan som nmol g−1 FW.
För bedömning av icke-enzymatiska och enzymatiska antioxidanter samlades blad (andra och tredje fullt utvecklade blad från toppen) in från varje biologiskt replikat 72 timmar efter behandling (hpt). Varje biologiskt replikat bestod av fem krukor (två plantor per kruka). Varje biologiskt prov analyserades i duplikat (två tekniska prover). Två blad maldes med flytande kväve och användes direkt för bestämning av enzymatiska och icke-enzymatiska antioxidanter, totala aminosyror, prolinhalt, genuttryck och oxalatkvantifiering.
Totala lösliga fenoler bestämdes med hjälp av Folin-Ciocalteu-reagens (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) med smärre modifieringar av metoden som beskrivs av Kahkonen et al. (1999). Kortfattat extraherades cirka 0,1 g homogeniserad bladvävnad med 20 ml 80 % metanol i mörker i 24 timmar och supernatanten samlades upp efter centrifugering. 0,1 ml av provextraktet blandades med 0,5 ml Folin-Ciocalteu-reagens (10 %), skakades i 30 sekunder och lämnades i mörker i 5 minuter. Därefter tillsattes 0,5 ml 20 % natriumkarbonatlösning (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Kairo, Egypten) till varje rör, blandades noggrant och inkuberades vid rumstemperatur i mörker i 1 timme. Efter inkubation mättes reaktionsblandningens absorbans vid 765 nm med hjälp av en UV-160A-spektrofotometer (Shimadzu Corporation, Japan). Koncentrationen av totala lösliga fenoler i provextrakten bestämdes med hjälp av en gallussyrakalibreringskurva (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) och uttrycktes som milligram gallussyraekvivalent per gram färskvikt (mg GAE g-1 färskvikt).
Totalt innehåll av lösliga flavonoider bestämdes enligt metoden av Djeridane et al. (2006) med smärre modifieringar. Kortfattat blandades 0,3 ml av ovanstående metanolextrakt med 0,3 ml 5 % aluminiumkloridlösning (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA), omrördes kraftigt och inkuberades sedan vid rumstemperatur i 5 minuter, följt av tillsats av 0,3 ml 10 % kaliumacetatlösning (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kairo, Egypten), blandades noggrant och inkuberades vid rumstemperatur i 30 minuter i mörker. Efter inkubation mättes reaktionsblandningens absorbans vid 430 nm med hjälp av en UV-160A-spektrofotometer (Shimadzu Corporation, Japan). Koncentrationen av totala lösliga flavonoider i provextrakten bestämdes med hjälp av en rutinkalibreringskurva (TCI America, Portland, OR, USA) och uttrycktes sedan som milligram rutinekvivalent per gram färskvikt (mg RE g-1 färskvikt).
Det totala innehållet av fria aminosyror i bönblad bestämdes med hjälp av ett modifierat ninhydrinreagens (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) baserat på metoden som föreslagits av Yokoyama och Hiramatsu (2003) och modifierats av Sun et al. (2006). Kortfattat extraherades 0,1 g mald vävnad med buffert pH 5,4, och 200 μl av supernatanten reagerade med 200 μl ninhydrin (2%) och 200 μl pyridin (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA), inkuberades i ett kokande vattenbad i 30 minuter, kyldes sedan och mättes vid 580 nm med en UV-160A-spektrofotometer (Shimadzu Corporation, Japan). Prolin bestämdes däremot med Bates-metoden (Bates et al., 1973). Prolin extraherades med 3 % sulfosalicylsyra (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) och efter centrifugering blandades 0,5 ml av supernatanten med 1 ml isättiksyra (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) och ninhydrinreagens, inkuberades vid 90 °C i 45 minuter, kyldes och mättes vid 520 nm med samma spektrofotometer som ovan. Totala fria aminosyror och prolin i bladextrakten bestämdes med hjälp av glycin- respektive prolinkalibreringskurvor (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) och uttrycktes som mg/g färskvikt.
För att bestämma den enzymatiska aktiviteten hos antioxidantenzymer extraherades cirka 500 mg homogeniserad vävnad med 3 ml 50 mM Tris-buffert (pH 7,8) innehållande 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) och 7,5 % polyvinylpyrrolidon (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), centrifugerades vid 10 000 × g i 20 minuter under kylning (4 °C), och supernatanten (rått enzymextrakt) uppsamlades (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Katalas (CAT) fick sedan reagera med 2 ml 0,1 M natriumfosfatbuffert (pH 6,5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) och 100 μl 269 mM H2O2-lösning för att bestämma dess enzymatiska aktivitet enligt Aebis metod (1984) med smärre modifieringar (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Guaiakolberoende peroxidas (POX) enzymatisk aktivitet bestämdes med hjälp av Harrach et al.s metod (2009). (2008) med mindre modifieringar (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) och den enzymatiska aktiviteten hos polyfenoloxidas (PPO) bestämdes efter reaktion med 2,2 ml 100 mM natriumfosfatbuffert (pH 6,0), 100 μl guaiakol (TCI chemicals, Portland, OR, USA) och 100 μl 12 mM H2O2. Metoden modifierades något från (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Analysen utfördes efter reaktion med 3 ml katekollösning (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0,01 M) färskframställd i 0,1 M fosfatbuffert (pH 6,0). CAT-aktivitet mättes genom att övervaka nedbrytningen av H2O2 vid 240 nm (A240), POX-aktivitet mättes genom att övervaka ökningen i absorbans vid 436 nm (A436), och PPO-aktivitet mättes genom att registrera absorbansfluktuationer vid 495 nm (A495) var 30:e sekund i 3 minuter med användning av en UV-160A-spektrofotometer (Shimadzu, Japan).
Realtids-RT-PCR användes för att detektera transkriptnivåerna av tre antioxidantrelaterade gener, inklusive peroxisomalt katalas (PvCAT1; GenBank-accessionsnummer KF033307.1), superoxiddismutas (PvSOD; GenBank-accessionsnummer XM_068639556.1) och glutationreduktas (PvGR; GenBank-accessionsnummer KY195009.1), i bönblad (det andra och tredje fullt utvecklade bladet från toppen) 72 timmar efter den sista behandlingen. Kortfattat isolerades RNA med hjälp av Simply P Total RNA Extraction Kit (katalognummer BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Kina) enligt tillverkarens protokoll. Därefter syntetiserades cDNA med hjälp av TOP script™ cDNA Synthesis Kit enligt tillverkarens instruktioner. Primersekvenserna för ovanstående tre gener listas i tilläggstabell S3. PvActin-3 (GenBank-accessionsnummer: XM_068616709.1) användes som hushållsgen och det relativa genuttrycket beräknades med 2-ΔΔCT-metoden (Livak och Schmittgen, 2001). Aktinstabilitet under biotisk stress (inkompatibel interaktion mellan vanliga baljväxter och antraknossvampen Colletotrichum lindemuthianum) och abiotisk stress (torka, salthalt, låg temperatur) demonstrerades (Borges et al., 2012).
Vi utförde initialt en genomomfattande in silico-analys av oxaloacetatacetylhydrolas (OAH)-proteiner i S. sclerotiorum med hjälp av protein-protein BLAST-verktyget (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Kortfattat använde vi OAH från Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxid: 1191702; GenBank-accessionsnummer XP_040799428.1; 342 aminosyror) och Penicillium lagena (PlOAH; taxid: 94218; GenBank-accessionsnummer XP_056833920.1; 316 aminosyror) som frågesekvenser för att kartlägga det homologa proteinet i S. sclerotiorum (taxid: 5180). BLASTp utfördes mot de senast tillgängliga S. sclerotiorum-genomdata i GenBank på National Center for Biotechnology Information (NCBI) webbplats, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Dessutom härleddes den predikterade OAH-genen från S. sclerotiorum (SsOAH) och den evolutionära analysen och det fylogenetiska trädet för AfOAH från A. fijiensis CBS 313.89 och PlOAH från P. lagena med hjälp av maximum likelihood-metoden i MEGA11 (Tamura et al., 2021) och den JTT-matrisbaserade modellen (Jones et al., 1992). Det fylogenetiska trädet kombinerades med multipel alignment-analys av proteinsekvenser för alla predikterade OAH-gener (SsOAH) från S. sclerotiorum och frågesekvensen med hjälp av Constraint-Based Alignment Tool (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos och Agarwala, 2007). Dessutom justerades de bäst matchande aminosyrasekvenserna för SsOAH från S. sclerotiorum med frågesekvenserna (AfOAH och PlOAH) (Larkin et al., 2007) med hjälp av ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), och konserverade regioner i aligneringen visualiserades med hjälp av ESPript-verktyget (version 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Dessutom klassificerades de förutspådda funktionella representativa domänerna och konserverade platserna för S. sclerotiorum SsOAH interaktivt i olika familjer med hjälp av InterPro-verktyget (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Slutligen utfördes tredimensionell (3D) strukturmodellering av den förutspådda S. sclerotiorum SsOAH med hjälp av Protein Homology/Analogy Recognition Engine (Phyre2-server version 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) och validerades med hjälp av SWISS-MODEL-servern (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). De förutspådda tredimensionella strukturerna (PDB-format) visualiserades interaktivt med hjälp av UCSF-Chimera-paketet (version 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen et al., 2004).
Kvantitativ realtidsfluorescens-PCR användes för att bestämma transkriptionsnivån av oxaloacetatacetylhydrolas (SsOAH; GenBank-accessionsnummer: XM_001590428.1) i myceliet hos Sclerotinia sclerotiorum. Kortfattat inokulerades S. sclerotiorum i en kolv innehållande PDB och placerades i en skakinkubator (modell: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) vid 25 ± 2 °C i 24 timmar vid 150 rpm och i konstant mörker (24 timmar) för att stimulera myceltillväxt. Därefter behandlades cellerna med L-ornitin och fungiciden Rizolex-T vid slutliga IC50-koncentrationer (cirka 40 respektive 3,2 mg/L) och odlades sedan i ytterligare 24 timmar under samma förhållanden. Efter inkubation centrifugerades kulturerna vid 2500 rpm i 5 minuter och supernatanten (svampmycel) samlades in för genuttrycksanalys. På liknande sätt samlades svampmycel in 0, 24, 48, 72, 96 och 120 timmar efter infektion från infekterade växter som hade bildat vitmögel och bomullsmycel på ytan av infekterade vävnader. RNA extraherades från svampmycelet och sedan syntetiserades cDNA enligt beskrivningen ovan. Primersekvenserna för SsOAH listas i tilläggstabell S3. SsActin (GenBank-accessionsnummer: XM_001589919.1) användes som hushållsgen, och relativ genuttryck beräknades med hjälp av 2-ΔΔCT-metoden (Livak och Schmittgen, 2001).
Oxalsyra bestämdes i potatisdextrosbuljong (PDB) och växtprover innehållande svamppatogenen Sclerotinia sclerotiorum enligt metoden av Xu och Zhang (2000) med smärre modifieringar. Kortfattat inokulerades S. sclerotiorum-isolat i kolvar innehållande PDB och odlades sedan i en skakinkubator (modell I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) vid 150 rpm vid 25 ± 2 °C i 3–5 dagar i konstant mörker (24 timmar) för att stimulera myceltillväxt. Efter inkubation filtrerades svampkulturen först genom Whatman #1 filterpapper och centrifugerades sedan vid 2500 rpm i 5 minuter för att avlägsna kvarvarande mycel. Supernatanten samlades in och förvarades vid 4 °C för ytterligare kvantitativ bestämning av oxalat. För beredning av växtprover extraherades cirka 0,1 g växtvävnadsfragment tre gånger med destillerat vatten (2 ml varje gång). Proverna centrifugerades sedan vid 2500 rpm i 5 minuter, supernatanten torrfiltrerades genom Whatman nr 1 filterpapper och samlades in för vidare analys.
För kvantitativ analys av oxalsyra bereddes reaktionsblandningen i ett glasförsett rör i följande ordning: 0,2 ml prov (eller PDB-kulturfiltrat eller oxalsyrastandardlösning), 0,11 ml bromfenolblått (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, USA), 0,198 ml 1 M svavelsyra (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kairo, Egypten) och 0,176 ml 100 mM kaliumdikromat (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, USA), och sedan späddes lösningen till 4,8 ml med destillerat vatten, blandades kraftigt och placerades omedelbart i ett 60 °C vattenbad. Efter 10 minuter stoppades reaktionen genom att tillsätta 0,5 ml natriumhydroxidlösning (NaOH; 0,75 M). Reaktionsblandningens absorbans (A600) mättes vid 600 nm med en UV-160-spektrofotometer (Shimadzu Corporation, Japan). PDB och destillerat vatten användes som kontroller för kvantifiering av kulturfiltrat respektive växtprover. Oxalsyrakoncentrationerna i kulturfiltraten, uttryckta som mikrogram oxalsyra per milliliter PDB-medium (μg.mL⁻¹), och i bladextrakten, uttryckta som mikrogram oxalsyra per gram färskvikt (μg.g⁻¹ FW), bestämdes med hjälp av en oxalsyrakalibreringskurva (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA).
Under hela studien utformades alla experiment i en helt randomiserad design (CRD) med sex biologiska replikat per behandling och fem krukor per biologiskt replikat (två plantor per kruka) om inget annat anges. Biologiska replikat analyserades i duplikat (två tekniska replikat). Tekniska replikat användes för att kontrollera reproducerbarheten av samma experiment men användes inte i den statistiska analysen för att undvika falska replikat. Data analyserades statistiskt med hjälp av variansanalys (ANOVA) följt av Tukey-Kramer Honestly Significant Difference (HSD) test (p ≤ 0,05). För in vitro-experiment beräknades IC50- och IC99-värden med hjälp av probitmodellen och 95 % konfidensintervall beräknades.
Totalt fyra isolat samlades in från olika sojabönsfält i El Ghabiya-guvernementet i Egypten. På PDA-medium producerade alla isolat krämvitt mycel som snabbt blev bomullsvitt (Figur 1A) och sedan beige eller brunt i sklerotiestadiet. Sklerotier är vanligtvis täta, svarta, sfäriska eller oregelbundna i formen, 5,2 till 7,7 mm långa och 3,4 till 5,3 mm i diameter (Figur 1B). Även om fyra isolat utvecklade ett marginellt mönster av sklerotier vid kanten av odlingsmediet efter 10–12 dagars inkubation vid 25 ± 2 °C (Fig. 1A), var antalet sklerotier per platta signifikant olika mellan dem (P < 0,001), där isolat 3 hade det högsta antalet sklerotier (32,33 ± 1,53 sklerotier per platta; Fig. 1C). På liknande sätt producerade isolat #3 mer oxalsyra i PDB än andra isolat (3,33 ± 0,49 μg.mL−1; Fig. 1D). Isolat #3 uppvisade typiska morfologiska och mikroskopiska egenskaper hos den fytopatogena svampen Sclerotinia sclerotiorum. Till exempel, på PDA växte kolonier av isolat #3 snabbt, var krämvita (Figur 1A), omvänd beige eller ljus laxgulbruna och krävde 6–7 dagar vid 25 ± 2 °C för att helt täcka ytan av en platta med 9 cm diameter. Baserat på ovanstående morfologiska och mikroskopiska egenskaper identifierades isolat #3 som Sclerotinia sclerotiorum.
Figur 1. Egenskaper och patogenicitet hos S. sclerotiorum-isolat från vanliga baljväxter. (A) Myceltillväxt hos fyra S. sclerotiorum-isolat på PDA-medium, (B) sklerotier hos fyra S. sclerotiorum-isolat, (C) antal sklerotier (per platta), (D) oxalsyrasekretion på PDB-medium (μg.mL−1) och (E) sjukdomens svårighetsgrad (%) hos fyra S. sclerotiorum-isolat på den mottagliga kommersiella baljväxtkultivaren Giza 3 under växthusförhållanden. Värdena representerar medelvärdet ± SD för fem biologiska replikat (n = 5). Olika bokstäver indikerar statistiskt signifikanta skillnader mellan behandlingar (p < 0,05). (F–H) Typiska vitmögelsymtom uppträdde på ovanjordiska stjälkar respektive silikoner 10 dagar efter inokulering med isolat #3 (dpi). (I) Evolutionär analys av den interna transkriberade spacerregionen (ITS) hos S. sclerotiorum-isolat nr 3 utfördes med hjälp av maximum likelihood-metoden och jämfördes med 20 referensisolat/stammar erhållna från National Center for Biotechnology Information (NCBI)-databasen (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Siffrorna ovanför klusterlinjerna anger regionens täckning (%) och siffrorna under klusterlinjerna anger grenlängden.
För att bekräfta patogeniciteten användes dessutom fyra erhållna S. sclerotiorum-isolat för att inokulera den mottagliga kommersiella bönsorten Giza 3 under växthusförhållanden, vilket överensstämmer med Kochs postulat (Fig. 1E). Även om alla erhållna svampisolater var patogena och kunde infektera den gröna bönan (cv. Giza 3), vilket orsakade typiska vitmögelsymtom på alla ovanjordiska delar (Fig. 1F), särskilt på stjälkarna (Fig. 1G) och baljorna (Fig. 1H) 10 dagar efter inokulering (dpi), var isolat 3 det mest aggressiva isolatet i två oberoende experiment. Isolat 3 hade den högsta sjukdomssvårighetsgraden (%) på bönplantor (24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0 respektive 76,7 ± 3,1 7, 14 respektive 21 dagar efter infektion; Figur 1F).
Identifieringen av det mest invasiva S. sclerotiorum-isolatet #3 bekräftades ytterligare baserat på intern transkriberad spacer (ITS)-sekvensering (Fig. 1I). Fylogenetisk analys mellan isolat #3 och 20 referensisolat/stammar visade hög likhet (>99%) mellan dem. Det är värt att notera att S. sclerotiorum-isolatet #3 (533 bp) har en hög likhet med det amerikanska S. sclerotiorum-isolatet LPM36 isolerat från torkade ärtfrön (GenBank-accessionsnummer MK896659.1; 540 bp) och det kinesiska S. sclerotiorum-isolatet YKY211 (GenBank-accessionsnummer OR206374.1; 548 bp), vilket orsakar violett (Matthiola incana) stjälkröta, vilka alla är grupperade separat högst upp i dendrogrammet (Figur 1I). Den nya sekvensen har deponerats i NCBI:s databas och fått namnet ”Sclerotinia sclerotiorum – isolat YN-25” (GenBank-accessionsnummer PV202792). Det framgår att isolat 3 är det mest invasiva isolatet; därför valdes detta isolat för studier i alla efterföljande experiment.
Den antibakteriella aktiviteten hos diaminen L-ornitin (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Tyskland) vid olika koncentrationer (12,5, 25, 50, 75, 100 och 125 mg/L) mot S. sclerotiorum-isolat 3 undersöktes in vitro. Det är värt att notera att L-ornitin utövade en antibakteriell effekt och gradvis hämmade den radiella tillväxten av S. sclerotiorum-hyfer på ett dosberoende sätt (Figur 2A, B). Vid den högsta testade koncentrationen (125 mg/L) uppvisade L-ornitin den högsta hämningsgraden för myceltillväxt (99,62 ± 0,27 %; Figur 2B), vilket var likvärdigt med den kommersiella fungiciden Rizolex-T (hämningsgrad 99,45 ± 0,39 %; Figur 2C) vid den högsta testade koncentrationen (10 mg/L), vilket indikerar liknande effekt.
Figur 2. Antibakteriell aktivitet in vitro av L-ornitin mot Sclerotinia sclerotiorum. (A) Jämförelse av den antibakteriella aktiviteten av olika koncentrationer av L-ornitin mot S. sclerotiorum med den kommersiella fungiciden Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Hämningsgrad (%) av S. sclerotiorum myceltillväxt efter behandling med olika koncentrationer av L-ornitin (12,5, 25, 50, 75, 100 respektive 125 mg/L) eller Rizolex-T (2, 4, 6, 8 respektive 10 mg/L). Värdena representerar medelvärdet ± SD av fem biologiska replikat (n = 5). Olika bokstäver anger statistiska skillnader mellan behandlingar (p < 0,05). (D, E) Probitmodellregressionsanalys av L-ornitin respektive kommersiell fungicid Rizolex-T. Probitmodellens regressionslinje visas som en heldragen blå linje och konfidensintervallet (95 %) visas som en streckad röd linje.
Dessutom utfördes probitregressionsanalys och motsvarande diagram visas i tabell 1 och figur 2D, E. Kortfattat indikerade det acceptabla lutningsvärdet (y = 2,92x − 4,67) och tillhörande signifikant statistik (Cox & Snell R2 = 0,3709, Nagelkerke R2 = 0,4998 och p < 0,0001; figur 2D) för L-ornitin en förbättrad svampdödande aktivitet mot S. sclerotiorum jämfört med det kommersiella fungiciden Rizolex-T (y = 1,96x − 0,99, Cox & Snell R2 = 0,1242, Nagelkerke R2 = 0,1708 och p < 0,0001) (tabell 1).
Tabell 1. Värden för halvmaximal hämmande koncentration (IC50) och IC99 (mg/l) av L-ornitin och den kommersiella fungiciden "Rizolex-T" mot S. sclerotiorum.
Sammantaget minskade L-ornitin (250 mg/L) signifikant utvecklingen och svårighetsgraden av vitmögel på behandlade vanliga bönplantor jämfört med obehandlade S. sclerotiorum-infekterade plantor (kontroll; figur 3A). Kortfattat, även om sjukdomens svårighetsgrad hos obehandlade infekterade kontrollplantor gradvis ökade (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61 och 92,33 ± 3,06%), minskade L-ornitin signifikant sjukdomens svårighetsgrad (%) under hela experimentet (8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00 och 26,36 ± 3,07) 7, 14 respektive 21 dagar efter behandling (dpt) (figur 3A). På liknande sätt minskade arean under sjukdomsprogressionskurvan (AUDPC) från 1274,33 ± 33,13 i den obehandlade kontrollen till 281,03 ± 7,95, när S. sclerotiorum-infekterade bönplantor behandlades med 250 mg/L L-ornitin, vilket var något lägre än för den positiva kontrollen 50 mg/L Rizolex-T-fungiciden (183,61 ± 7,71; Fig. 3B). Samma trend observerades i det andra experimentet.
Fig. 3. Effekt av exogen applicering av L-ornitin på utvecklingen av vitröta hos vanliga bönor orsakad av Sclerotinia sclerotiorum under växthusförhållanden. (A) Sjukdomsprogressionskurva för vitmögel hos vanliga bönor efter behandling med 250 mg/L L-ornitin. (B) Arean under sjukdomsprogressionskurvan (AUDPC) för vitmögel hos vanliga bönor efter behandling med L-ornitin. Värdena representerar medelvärdet ± SD av fem biologiska replikat (n = 5). Olika bokstäver anger statistiskt signifikanta skillnader mellan behandlingarna (p < 0,05).
Exogen applicering av 250 mg/L L-ornitin ökade gradvis plantans höjd (Fig. 4A), antalet grenar per planta (Fig. 4B) och antalet blad per planta (Fig. 4C) efter 42 dagar. Medan den kommersiella fungiciden Rizolex-T (50 mg/L) hade störst effekt på alla studerade näringsparametrar, hade exogen applicering av 250 mg/L L-ornitin den näst största effekten jämfört med obehandlade kontroller (Fig. 4A–C). Å andra sidan hade L-ornitinbehandling ingen signifikant effekt på innehållet av fotosyntetiska pigmenten klorofyll a (Fig. 4D) och klorofyll b (Fig. 4E), men ökade den totala karotenoidhalten något (0,56 ± 0,03 mg/g fr wt) jämfört med den negativa kontrollen (0,44 ± 0,02 mg/g fr wt) och den positiva kontrollen (0,46 ± 0,02 mg/g fr wt; Fig. 4F). Sammantaget indikerar dessa resultat att L-ornitin inte är fytotoxiskt för behandlade baljväxter och till och med kan stimulera deras tillväxt.
Fig. 4. Effekt av exogen L-ornitin-applicering på tillväxtegenskaper och fotosyntetiska pigment hos bönblad infekterade med Sclerotinia sclerotiorum under växthusförhållanden. (A) Planthöjd (cm), (B) Antal grenar per planta, (C) Antal blad per planta, (D) Klorofyll a-halt (mg g-1 fr wt), (E) Klorofyll b-halt (mg g-1 fr wt), (F) Total karotenoidhalt (mg g-1 fr wt). Värdena är medelvärdet ± standardavvikelse (SD) av fem biologiska replikat (n = 5). Olika bokstäver indikerar statistiskt signifikanta skillnader mellan behandlingarna (p < 0,05).
In situ histokemisk lokalisering av reaktiva syreradikaler (ROS; uttryckt som väteperoxid [H2O2]) och fria radikaler (uttryckta som superoxidanjoner [O2•−]) visade att exogen applicering av L-ornitin (250 mg/L) signifikant minskade ackumuleringen av H2O2 (96,05 ± 5,33 nmol.g−1 FW; Fig. 5A) och O2•− (32,69 ± 8,56 nmol.g−1 FW; Fig. 5B) jämfört med ackumuleringen av både obehandlade infekterade växter (173,31 ± 12,06 respektive 149,35 ± 7,94 nmol.g−1 FW) och växter behandlade med 50 mg/L av den kommersiella fungiciden Rizolex-T (170,12 ± 9,50 respektive 157,00 ± 7,81 nmol.g−1 fr wt) vid 72 timmar. Höga nivåer av H2O2 och O2•− ackumulerades under hpt (Fig. 5A, B). På liknande sätt visade TCA-baserad malondialdehyd (MDA)-analys att S. sclerotiorum-infekterade bönplantor ackumulerade högre nivåer av MDA (113,48 ± 10,02 nmol.g fr wt) i sina blad (Fig. 5C). Exogen applicering av L-ornitin minskade dock signifikant lipidperoxidationen, vilket framgår av minskningen av MDA-innehållet i behandlade plantor (33,08 ± 4,00 nmol.g fr wt).
Fig. 5. Effekt av exogen L-ornitin-applicering på viktiga markörer för oxidativ stress och icke-enzymatiska antioxidantförsvarsmekanismer i bönblad infekterade med S. sclerotiorum 72 timmar efter infektion under växthusförhållanden. (A) Väteperoxid (H2O2; nmol g−1 FW) vid 72 hpt, (B) superoxidanjon (O2•−; nmol g−1 FW) vid 72 hpt, (C) malondialdehyd (MDA; nmol g−1 FW) vid 72 hpt, (D) totala lösliga fenoler (mg GAE g−1 FW) vid 72 hpt, (E) totala lösliga flavonoider (mg RE g−1 FW) vid 72 hpt, (F) totala fria aminosyror (mg g−1 FW) vid 72 hpt, och (G) prolinhalt (mg g−1 FW) vid 72 hpt. Värdena representerar medelvärdet ± standardavvikelsen (medelvärde ± SD) för 5 biologiska replikat (n = 5). Olika bokstäver indikerar statistiskt signifikanta skillnader mellan behandlingarna (p < 0,05).