Tack för att du besöker Nature.com. Webbläsarversionen du använder har begränsat stöd för CSS. För bästa möjliga upplevelse rekommenderar vi att du använder en uppdaterad webbläsare (eller stänger av kompatibilitetsläge i Internet Explorer). Under tiden, för att säkerställa fortsatt stöd, kommer vi att visa webbplatsen utan stilar och JavaScript.
Insulinnanopartiklar (NP) med hög laddningshalt har funnit olika tillämpningar i olika doseringsformer. Detta arbete syftar till att utvärdera effekten av frystorknings- och spraytorkningsprocesser på strukturen hos insulinladdade kitosan-nanopartiklar, med eller utan mannitol som kryoskyddsmedel. Vi bedömde också kvaliteten på dessa nanopartiklar genom att återupplösa dem. Före dehydrering optimerades partikelstorleken hos de kitosan/natriumtripolyfosfat/insulin-tvärbundna nanopartiklarna till 318 nm, PDI var 0,18, inkapslingseffektiviteten var 99,4 % och laddningen var 25,01 %. Efter rekonstitution behöll alla nanopartiklar, förutom de som producerats med en frystorkningsmetod utan användning av mannitol, sin sfäriska partikelstruktur. Jämfört med mannitolinnehållande nanopartiklar som dehydrerats med antingen spray, visade mannitolfria spraytorkade nanopartiklar också den minsta genomsnittliga partikelstorleken (376 nm) och den högsta laddningshalten. (25,02 %) med liknande inkapslingsgrad (98,7 %) och PDI (0,20) med torknings- eller frystorkningstekniker. De torkade nanopartiklarna genom spraytorkning utan mannitol resulterade också i den snabbaste frisättningen av insulin och den högsta effektiviteten av cellulärt upptag. Detta arbete visar att spraytorkning kan dehydrera insulinnanopartiklar utan behov av kryoskyddsmedel jämfört med konventionella frystorkningsmetoder, vilket skapar större belastningskapacitet, lägre tillsatsbehov och driftskostnader, vilket ger en betydande fördel.
Sedan upptäckten 19221,2,3 har insulin och dess farmaceutiska preparat räddat livet på patienter med typ 1-diabetes (T1DM) och typ 2-diabetes (T1DM). På grund av dess egenskaper som ett protein med hög molekylvikt aggregeras insulin dock lätt, bryts ner av proteolytiska enzymer och elimineras genom förstapassageeffekten. Personer som diagnostiseras med typ 1-diabetes behöver insulininjektioner resten av sina liv. Många patienter som initialt diagnostiseras med typ 2-diabetes behöver också långvariga insulininjektioner. Dagliga insulininjektioner är en allvarlig källa till daglig smärta och obehag för dessa individer, med negativa effekter på den psykiska hälsan. Som ett resultat studeras andra former av insulinadministrering som orsakar mindre obehag, såsom oral insulinadministrering, omfattande5 eftersom de har potential att återställa livskvaliteten för cirka 5 miljarder människor med diabetes världen över.
Nanopartikelteknik har gett betydande framsteg i försöken att ta oralt insulin4,6,7. Ett insulin som effektivt inkapslar och skyddar insulin från nedbrytning för riktad administrering till specifika kroppsdelar. Användningen av nanopartikelformuleringar har dock flera begränsningar, främst på grund av stabilitetsproblem med partikelsuspensioner. Viss aggregering kan uppstå under lagring, vilket minskar biotillgängligheten hos insulinbelastade nanopartiklar8. Dessutom måste den kemiska stabiliteten hos polymermatrisen av nanopartiklar och insulin också beaktas för att säkerställa stabiliteten hos insulinnanopartiklar (NP). För närvarande är frystorkningsteknik guldstandarden för att skapa stabila NP samtidigt som oönskade förändringar under lagring förhindras9.
Frystorkning kräver dock tillsats av kryoskyddsmedel för att förhindra att den sfäriska strukturen hos nanopartiklarna påverkas av den mekaniska stressen från iskristaller. Detta minskar avsevärt mängden insulinnanopartiklar efter frystorkning, eftersom kryoskyddsmedlet upptar större delen av viktförhållandet. Därför visar sig de producerade insulinnanopartiklarna ofta vara olämpliga för tillverkning av torra pulverformuleringar, såsom orala tabletter och orala filmer, på grund av behovet av stora mängder torra nanopartiklar för att uppnå insulinets terapeutiska fönster.
Spraytorkning är en välkänd och billig process i industriell skala för att producera torra pulver från flytande faser inom läkemedelsindustrin10,11. Kontroll över partikelbildningsprocessen möjliggör korrekt inkapsling av flera bioaktiva föreningar12, 13. Dessutom har det blivit en effektiv teknik för framställning av inkapslade proteiner för oral administrering. Under spraytorkning avdunstar vatten mycket snabbt, vilket hjälper till att hålla temperaturen i partikelkärnan låg11,14, vilket möjliggör applicering för att inkapsla värmekänsliga komponenter. Före spraytorkning bör beläggningsmaterialet homogeniseras noggrant med lösningen som innehåller de inkapslade ingredienserna11,14. Till skillnad från frystorkning förbättrar homogenisering före inkapsling vid spraytorkning inkapslingseffektiviteten under dehydrering. Eftersom spraytorkningsinkapslingsprocessen inte kräver kryoskyddsmedel kan spraytorkning användas för att producera torkade NP med hög laddningshalt.
Denna studie rapporterar produktionen av insulinbelastade nanopartiklar genom tvärbindning av kitosan och natriumtripolyfosfat med hjälp av en jonkelmetod. Jongelering är en beredningsmetod som möjliggör produktion av nanopartiklar genom elektrostatiska interaktioner mellan två eller flera jonarter under vissa förhållanden. Både frystorknings- och spraytorkningstekniker användes för att dehydrera de optimerade kitosan/natriumtripolyfosfat/insulin-tvärbundna nanopartiklarna. Efter dehydrering analyserades deras morfologi med SEM. Deras rekombinationsförmåga utvärderades genom att mäta deras storleksfördelning, ytladdning, PDI, inkapslingseffektivitet och laddningsinnehåll. Kvaliteten på resolubiliserade nanopartiklar producerade med olika dehydreringsmetoder utvärderades också genom att jämföra deras insulinskydd, frisättningsbeteende och cellulära upptagseffektivitet.
pH-värdet i den blandade lösningen och förhållandet mellan kitosan och insulin är två nyckelfaktorer som påverkar partikelstorleken och inkapslingseffektiviteten (EE) för de slutliga nanopartiklarna, eftersom de direkt påverkar den jonotropa gelningsprocessen. pH-värdet i den blandade lösningen visade sig vara starkt korrelerat med partikelstorlek och inkapslingseffektivitet (Fig. 1a). Som visas i Fig. 1a, när pH ökade från 4,0 till 6,0, minskade den genomsnittliga partikelstorleken (nm) och EE ökade signifikant, medan när pH ökade till 6,5 började den genomsnittliga partikelstorleken öka och EE förblev oförändrad. När förhållandet mellan kitosan och insulin ökar, ökar också den genomsnittliga partikelstorleken. Dessutom observerades ingen förändring i EE när nanopartiklar framställdes vid ett massförhållande kitosan/insulin högre än 2,5:1 (vikt/vikt) (Fig. 1b). Därför användes de optimala framställningsförhållandena i denna studie (pH 6,0, massförhållande kitosan/insulin på 2,5:1). för att framställa insulinladdade nanopartiklar för vidare studier. Under dessa framställningsförhållanden optimerades den genomsnittliga partikelstorleken för insulinnanopartiklarna till 318 nm (Fig. 1c), PDI var 0,18, inbäddningseffektiviteten var 99,4%, zetapotentialen var 9,8 mV och insulinbelastningen var 25,01% (m/m). Baserat på resultat från transmissionselektronmikroskopi (TEM) var de optimerade nanopartiklarna ungefär sfäriska och diskreta med relativt enhetlig storlek (Fig. 1d).
Parameteroptimering av insulinnanopartiklar: (a) effekten av pH på medeldiametern och inkapslingseffektiviteten (EE) hos insulinnanopartiklar (framställda med ett massförhållande på 5:1 mellan kitosan och insulin); (b) kitosan och inverkan av insulinets massförhållande på medeldiametern och inkapslingseffektiviteten (EE) hos insulinnanopartiklar (framställda vid pH 6); (c) partikelstorleksfördelning hos optimerade insulinnanopartiklar; (d) TEM-mikrograf av optimerade insulinnanopartiklar.
Det är välkänt att kitosan är en svag polyelektrolyt med ett pKa-värde på 6,5. Den är positivt laddad i sura medier eftersom dess huvudsakliga aminogrupp protoneras av vätejoner15. Därför används den ofta som bärare för att inkapsla negativt laddade makromolekyler. I denna studie användes kitosan för att inkapsla insulin med en isoelektrisk punkt på 5,3. Eftersom kitosan används som beläggningsmaterial ökar tjockleken på det yttre lagret av nanopartiklarna i motsvarande grad med ökande andel, vilket resulterar i en större genomsnittlig partikelstorlek. Dessutom kan högre nivåer av kitosan inkapsla mer insulin. I vårt fall var EE högst när förhållandet mellan kitosan och insulin nådde 2,5:1, och det skedde ingen signifikant förändring i EE när förhållandet fortsatte att öka.
Förutom förhållandet mellan kitosan och insulin spelade även pH en avgörande roll vid framställningen av nanopartiklar. Gan et al. 17 studerade effekten av pH på partikelstorleken hos kitosan-nanopartiklar. De fann en kontinuerlig minskning av partikelstorleken tills pH nådde 6,0, och en signifikant ökning av partikelstorleken observerades vid pH > 6,0, vilket överensstämmer med våra observationer. Detta fenomen beror på att med ökande pH får insulinmolekylen en negativ ytladdning, vilket gynnar elektrostatiska interaktioner med kitosan/natriumtripolyfosfat (TPP)-komplexet, vilket resulterar i liten partikelstorlek och hög EE. Men när pH justerades till 6,5 deprotonerades aminogrupperna på kitosan, vilket resulterade i kitosanveckning. Således resulterar högt pH i mindre exponering av aminojoner för TPP och insulin, vilket resulterar i lägre tvärbindning, större slutlig genomsnittlig partikelstorlek och lägre EE.
Analys av de morfologiska egenskaperna hos frystorkade och spraytorkade nanopartiklar kan vägleda valet av bättre dehydrerings- och pulverbildningstekniker. Den föredragna metoden bör ge läkemedelsstabilitet, enhetlig partikelform, hög läkemedelsmängd och god löslighet i den ursprungliga lösningen. I denna studie, för att bättre jämföra de två teknikerna, användes insulin-nanopartiklar med eller utan 1 % mannitol under dehydrering. Mannitol används som ett bulkmedel eller kryoskyddsmedel i olika torra pulverformuleringar för frystorkning och spraytorkning. För de frystorkade insulin-nanopartiklarna utan mannitol, som visas i figur 2a, observerades en mycket porös pulverstruktur med stora, oregelbundna och grova ytor under svepelektronmikroskopi (SEM). Få diskreta partiklar detekterades i pulvret efter dehydrering (fig. 2e). Dessa resultat indikerade att de flesta nanopartiklarna sönderdelades under frystorkning utan något kryoskyddsmedel. För frystorkade och spraytorkade insulin-nanopartiklar innehållande 1 % mannitol observerades sfäriska nanopartiklar med släta ytor (fig. 2b, d, f, h). Insulin Nanopartiklar som spraytorkades utan mannitol förblev sfäriska men skrynkliga på ytan (Fig. 2c). Sfäriska och skrynkliga ytor diskuteras vidare i testerna av frisättningsbeteende och cellulära upptag nedan. Baserat på det synliga utseendet hos de torkade nanopartiklarna gav både spraytorkade nanopartiklar utan mannitol och nanopartiklar som frystorkades och spraytorkades med mannitol fina nanopartiklar i pulverform (Fig. 2f, g, h). Ju större ytan mellan partikelytorna är, desto högre är lösligheten och därmed desto högre är frisättningshastigheten.
Morfologi för olika dehydrerade insulin-NP:er: (a) SEM-bild av frystorkade insulin-NP:er utan mannitol; (b) SEM-bild av frystorkade insulin-NP:er med mannitol; (c) spraytorkade insulin-NP:er utan mannitol SEM-bild av; (d) SEM-bild av insulin-NP:er spraytorkade med mannitol; (e) bild av frystorkade insulin-NP:er i pulverform utan mannitol; (f) bild av frystorkade insulin-NP:er med mannitol; (g) Bild av spraytorkade insulin-NP:er i pulverform utan mannitol; (h) bild av spraytorkade insulin-NP:er i pulverform med mannitol.
Under frystorkning fungerar mannitol som ett kryoskyddsmedel, vilket håller nanopartiklar i amorf form och förhindrar skador från iskristaller19. Däremot finns det inget frysningssteg under spraytorkning. Därför krävs inte mannitol i denna metod. Faktum är att spraytorkade nanopartiklar utan mannitol gav finare nanopartiklar som tidigare beskrivits. Mannitol kan dock fortfarande fungera som ett fyllmedel i spraytorkningsprocessen för att ge nanopartiklar en mer sfärisk struktur20 (Fig. 2d), vilket bidrar till att uppnå ett enhetligt frisättningsbeteende hos sådana inkapslade nanopartiklar. Dessutom är det tydligt att vissa stora partiklar kan detekteras i både frystorkade och spraytorkade insulin-nanopartiklar som innehåller mannitol (Fig. 2b, d), vilket kan bero på ansamling av mannitol i partikelkärnan tillsammans med det inkapslade insulinet. Till. Kitosanskikt. Det är värt att notera att i denna studie, för att säkerställa att den sfäriska strukturen förblir intakt efter dehydrering, hålls förhållandet mellan mannitol och kitosan vid 5:1, så att en stor mängd fyllmedel också kan förstora partikelstorleken hos de torkade nanopartiklarna.
Fouriertransform infraröd dämpad totalreflektion (FTIR-ATR) spektroskopi karakteriserade den fysikaliska blandningen av fritt insulin, kitosan, kitosan, TPP och insulin. Alla dehydrerade NP karakteriserades med hjälp av FTIR-ATR-spektroskopi. Det är värt att notera att bandintensiteter på 1641, 1543 och 1412 cm⁻¹ observerades i inkapslade NP frystorkade med mannitol och i NP spraytorkade med och utan mannitol (Fig. 3). Som tidigare rapporterats var dessa ökningar i styrka associerade med tvärbindning mellan kitosan, TPP och insulin. Undersökning av interaktionen mellan kitosan och insulin visade att i FTIR-spektra av insulinbelastade kitosan-nanopartiklar överlappade kitosanbandet med insulinets, vilket ökade karbonylintensitetsbältet (1641 cm⁻¹) och aminbältet (1543 cm⁻¹). Tripolyfosfatgrupperna i TPP är kopplade till ammoniumgrupper i kitosan och bildar ett band vid 1412 cm⁻¹.
FTIR-ATR-spektra av fritt insulin, kitosan, fysikaliska blandningar av kitosan/TPP/insulin och NP dehydrerade med olika metoder.
Dessutom överensstämmer dessa resultat med de som visats i SEM, vilket visade att de inkapslade NP:erna förblev intakta både när de sprayades och frystorkades med mannitol, men i frånvaro av mannitol producerade endast spraytorkning inkapslade partiklar. Däremot var FTIR-ATR-spektralresultaten för NP:er frystorkade utan mannitol mycket lika den fysiska blandningen av kitosan, TPP och insulin. Detta resultat indikerar att tvärbindningarna mellan kitosan, TPP och insulin inte längre finns i NP:er frystorkade utan mannitol. NP-strukturen förstördes under frystorkning utan kryoskyddsmedel, vilket kan ses i SEM-resultaten (Fig. 2a). Baserat på morfologin och FTIR-resultaten för dehydrerade insulin-NP:er användes endast frystorkade, spraytorkade och mannitolfria NP:er för rekonstitutionsexperiment och mannitolfria NP:er på grund av nedbrytningen av mannitolfria NP:er under dehydrering. diskutera.
Dehydrering används för långtidslagring och upparbetning till andra formuleringar. Förmågan hos torra nanopartiklar att rekonstitueras efter lagring är avgörande för deras användning i olika formuleringar såsom tabletter och filmer. Vi noterade att den genomsnittliga partikelstorleken för de spraytorkade insulin-nanopartiklarna i frånvaro av mannitol endast ökade något efter rekonstitution. Å andra sidan ökade partikelstorleken för de spraytorkade och frystorkade insulin-nanopartiklarna med mannitol signifikant (tabell 1). PDI och EE förändrades inte signifikant (p > 0,05) efter rekombination av alla nanopartiklar i denna studie (tabell 1). Detta resultat indikerar att de flesta partiklarna förblev intakta efter återupplösning. Tillsatsen av mannitol resulterade dock i en kraftigt minskad insulinmängd i frystorkade och spraytorkade mannitol-nanopartiklar (tabell 1). Däremot förblev insulinmängden i nanopartiklar spraytorkade utan mannitol densamma som tidigare (tabell 1).
Det är välkänt att laddningen av nanopartiklar är avgörande när de används för läkemedelsleverans. För NP med låga laddningar krävs mycket stora mängder material för att nå den terapeutiska tröskeln. Emellertid leder den höga viskositeten hos sådana höga NP-koncentrationer till olägenheter och svårigheter vid oral administrering respektive injicerbara formuleringar 22. Dessutom kan insulin-NP också användas för att tillverka tabletter och viskösa biofilmer 23, 24, vilket kräver användning av stora mängder NP vid låga laddningsnivåer, vilket resulterar i stora tabletter och tjocka biofilmer som inte är lämpliga för orala applikationer. Därför är dehydrerade NP med hög insulinbelastning mycket önskvärda. Våra resultat tyder på att den höga insulinbelastningen hos mannitolfria spraytorkade NP kan erbjuda många attraktiva fördelar för dessa alternativa leveransmetoder.
Alla dehydrerade NP förvarades i kylskåp i tre månader. SEM-resultat visade att morfologin hos alla dehydrerade NP inte förändrades signifikant under den tre månader långa lagringsperioden (Fig. 4). Efter rekonstitution i vatten uppvisade alla NP en liten minskning av EE och frisatte ungefär en liten mängd (~5%) insulin under den tre månader långa lagringsperioden (Tabell 2). Den genomsnittliga partikelstorleken för alla nanopartiklar ökade dock. Partikelstorleken för NP spraytorkade utan mannitol ökade till 525 nm, medan den för spraytorkade och frystorkade NP med mannitol ökade till 872 respektive 921 nm (Tabell 2).
Morfologi för olika dehydrerade insulin-nanopartiklar lagrade i tre månader: (a) SEM-bild av frystorkade insulin-nanopartiklar med mannitol; (b) SEM-bild av spraytorkade insulin-nanopartiklar utan mannitol; (c) SEM-bilder av spraytorkade insulin-nanopartiklar utan mannitol.
Dessutom observerades utfällningar i de rekonstituerade insulinnanopartiklarna som spraytorkats med mannitol och frystorkats (Fig. S2). Detta kan orsakas av att stora partiklar inte suspenderats ordentligt i vattnet. Alla ovanstående resultat visar att spraytorkningstekniken kan skydda insulinnanopartiklar från uttorkning och att höga halter av insulinnanopartiklar kan erhållas utan fyllnadsmedel eller kryoskyddsmedel.
Insulinretention testades i pH = 2,5 medium med pepsin, trypsin och α-kymotrypsin för att demonstrera den skyddande förmågan hos NP mot enzymatisk nedbrytning efter uttorkning. Insulinretentionen hos dehydrerade NP jämfördes med den hos nyframställda NP, och fritt insulin användes som negativ kontroll. I denna studie visade fritt insulin snabb insulineliminering inom 4 timmar i alla tre enzymatiska behandlingar (Fig. 5a–c). Däremot visade insulinelimineringstestning av NP frystorkade med mannitol och NP spraytorkade med eller utan mannitol signifikant högre skydd för dessa NP mot enzymatisk nedbrytning, vilket liknade det för nyframställda insulin-NP (figur 1). 5a-c). Med hjälp av nanopartiklar i pepsin, trypsin och α-kymotrypsin kunde mer än 50 %, 60 % respektive 75 % av insulinet skyddas inom 4 timmar (Fig. 5a–c). Denna insulinskyddande förmåga kan öka risken för högre insulinabsorption. i blodomloppet25. Dessa resultat tyder på att spraytorkning med eller utan mannitol och frystorkning med mannitol kan bevara den insulinskyddande förmågan hos NP:er efter uttorkning.
Skydd och frisättningsbeteende hos dehydrerade insulin-nanopartiklar: (a) skydd av insulin i pepsinlösning; (b) skydd av insulin i trypsinlösning; (c) skydd av insulin med α-kymotrypsinlösning; (d) Frisättningsbeteende hos dehydrerade nanopartiklar i en lösning med pH 2,5; (e) frisättningsbeteende hos dehydrerade nanopartiklar i en lösning med pH 6,6; (f) frisättningsbeteende hos dehydrerade nanopartiklar i en lösning med pH 7,0.
Nyligen framställda och rekonstituerade torra insulin-nanopartiklar inkuberades i olika buffertar (pH = 2,5, 6,6, 7,0) vid 37 °C, vilket simulerade pH-miljön i magsäcken, tolvfingertarmen och övre tunntarmen, för att undersöka insulinets effekt på insulinresistens. Frisättningsbeteende i olika miljöer. Fragment av mag-tarmkanalen. Vid pH = 2,5 uppvisade insulinbelastade NP och återlösliga torra insulin-NP en initial explosionsartad frisättning inom den första timmen, följt av en långsam frisättning under de kommande 5 timmarna (Fig. 5d). Denna snabba frisättning i början är troligtvis resultatet av snabb ytdesorption av proteinmolekyler som inte är helt immobiliserade i partikelns interna struktur. Vid pH = 6,5 uppvisade insulinbelastade NP och rekonstituerade torra insulin-NP en jämn och långsam frisättning över 6 timmar, eftersom testlösningens pH var liknande det för den NP-beredda lösningen (Fig. 5e). Vid pH = 7 var NP:erna instabila och nästan helt sönderdelade inom de första två timmarna (Fig. 5f). Detta beror på att deprotonering av kitosan sker vid högre pH, vilket resulterar i ett mindre kompakt polymernätverk och frisättning av laddat insulin.
Dessutom uppvisade de insulin-nanopartiklar som spraytorkades utan mannitol en snabbare frisättningsprofil än de andra dehydrerade nanopartiklarna (Fig. 5d–f). Som tidigare beskrivits uppvisade de rekonstituerade insulin-nanopartiklarna som torkades utan mannitol den minsta partikelstorleken. Små partiklar ger en större yta, så det mesta av det relevanta läkemedlet kommer att finnas vid eller nära partikelytan, vilket resulterar i snabb läkemedelsfrisättning26.
Cytotoxiciteten hos NP undersöktes med MTT-analys. Som visas i figur S4, visade sig alla dehydrerade NP inte ha någon signifikant effekt på cellviabiliteten vid koncentrationer på 50–500 μg/ml, vilket tyder på att alla dehydrerade NP säkert kan användas för att nå det terapeutiska fönstret.
Levern är det huvudsakliga organet genom vilket insulin utövar sina fysiologiska funktioner. HepG2-celler är en human hepatomcellinje som vanligtvis används som en in vitro-modell för hepatocytupptag. Här användes HepG2-celler för att bedöma cellulärt upptag av dehydrerade NP med hjälp av frystorknings- och spraytorkningsmetoder. Cellulärt upptag genom konfokal laserskanning med flödescytometri och syn efter flera timmars inkubation med fritt FITC-insulin vid en koncentration av 25 μg/ml, nyframställda FITC-insulinladdade NP och dehydrerade FITC-insulinladdade NP vid lika insulinkoncentrationer. Kvantitativa mikroskopiobservationer (CLSM) utfördes. Frystorkade NP utan mannitol förstördes under dehydrering och utvärderades inte i detta test. De intracellulära fluorescensintensiteterna hos nyframställda insulinladdade NP, frystorkade NP med mannitol och spraytorkade NP med och utan mannitol (Fig. 6a) var 4,3, 2,6, 2,4 och 4,1 gånger högre än de fria. FITC-insulin grupp, respektive (Fig. 6b). Dessa resultat tyder på att inkapslat insulin är mer potent i cellulärt upptag än fritt insulin, främst på grund av den mindre storleken på de insulinbelastade nanopartiklarna som producerades i studien.
HepG2-cellupptag efter 4 timmars inkubation med nyframställda NP och dehydrerade NP:er: (a) Fördelning av FITC-insulinupptag av HepG2-celler. (b) Geometriskt medelvärde av fluorescensintensiteter analyserade med flödescytometri (n = 3), *P < 0,05 jämfört med fritt insulin.
Likaså visade CLSM-bilderna att FITC-fluorescensintensiteterna hos nyframställda FITC-insulinladdade NP och FITC-insulinladdade spraytorkade NP (utan mannitol) var mycket starkare än hos de andra proverna (Fig. 6a). Dessutom, med tillsatsen av mannitol, ökade lösningens högre viskositet motståndet mot cellulärt upptag, vilket resulterade i minskad insulinproliferation. Dessa resultat tyder på att mannitolfria spraytorkade NP uppvisade den högsta cellulära upptagseffektiviteten eftersom deras partikelstorlek var mindre än hos frystorkade NP efter återupplösning.
Kitosan (genomsnittlig molekylvikt 100 kDa, 75–85 % deacetylerat) köptes från Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Kanada). Natriumtripolyfosfat (TPP) köptes från VWR (Radnor, Pennsylvania, USA). Rekombinant humant insulin som användes i denna studie kom från Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). Fluorescein-isotiocyanat (FITC)-märkt humant insulin och 4',6-diamidino-2-fenylindoldihydroklorid (DAPI) köptes från Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Kanada). HepG2-cellinjen erhölls från ATCC (Manassas, Virginia, USA). Alla andra reagens var av analytisk eller kromatografisk kvalitet.
Bered en 1 mg/ml CS-lösning genom att lösa den i dubbeldestillerat vatten (DD-vatten) innehållande 0,1 % ättiksyra. Bered 1 mg/ml lösningar av TPP och insulin genom att lösa dem i DD-vatten respektive 0,1 % ättiksyra. Föremulsionen framställdes med en polytron PCU-2-110 höghastighetshomogenisator (Brinkmann Ind. Westbury, NY, USA). Beredningsprocessen är som följer: först tillsätts 2 ml TPP-lösning till 4 ml insulinlösning, och blandningen omrörs i 30 minuter och blandas helt. Därefter tillsattes den blandade lösningen droppvis till CS-lösningen genom en spruta under höghastighetsomrörning (10 000 rpm). Blandningarna hölls under höghastighetsomrörning (15 000 rpm) i ett isbad i 30 minuter, och de justerades till ett visst pH för att erhålla tvärbundna insulin-NP. För att ytterligare homogenisera och minska partikelstorleken hos insulin-NP:erna sonikerades de i en ... ytterligare 30 minuter i ett isbad med hjälp av en sonikator av sondtyp (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Tyskland).
Insulin-NPS testades med avseende på Z-medeldiameter, polydispersitetsindex (PDI) och zetapotential med hjälp av dynamisk ljusspridning (DLS)-mätningar med en Litesizer 500 (Anton Paar, Graz, Österrike) genom att späda dem i DD-vatten vid 25 °C. Morfologi och storleksfördelning karakteriserades med ett Hitachi H7600 transmissionselektronmikroskop (TEM) (Hitachi, Tokyo, Japan), och bilderna analyserades därefter med hjälp av Hitachi-bildprogramvara (Hitachi, Tokyo, Japan). För att bedöma inkapslingseffektiviteten (EE) och laddningskapaciteten (LC) hos insulin-NP:er pipetterades NP:erna i ultrafiltreringsrör med en molekylviktsgräns på 100 kDa och centrifugerades vid 500 xg i 30 minuter. Oinkapslat insulin i filtratet kvantifierades med hjälp av ett Agilent 1100-seriens HPLC-system (Agilent, Santa Clara, Kalifornien, USA) bestående av en kvaternär pump, autosampler, kolonnvärmare och DAD. detektor. Insulin analyserades med en C18-kolonn (Zorbax, 3,5 μm, 4,6 mm × 150 mm, Agilent, USA) och detekterades vid 214 nm. Den mobila fasen var acetonitril och vatten, innehållande 0,1 % TFA, gradientförhållanden från 10/90 till 100/0, och kördes i 10 minuter. Den mobila fasen pumpades med en flödeshastighet av 1,0 ml/min. Kolonntemperaturen inställdes på 20 °C. Beräkna procentsatserna av EE och LC med hjälp av ekvationerna (1) och (2).
Olika CS/insulin-förhållanden från 2,0 till 4,0 testades för att optimera insulin-nanopartiklar. Olika mängder CS-lösning tillsattes under beredningen, medan insulin/TPP-blandningen hölls konstant. Insulin-nanopartiklar framställdes i pH-intervallet 4,0 till 6,5 genom att noggrant kontrollera blandningens pH efter tillsats av alla lösningar (insulin, TPP och CS). EE och partikelstorleken för insulin-nanopartiklar utvärderades vid olika pH-värden och CS/insulin-massförhållanden för att optimera bildandet av insulin-nanopartiklar.
De optimerade insulin-nanopartiklarna placerades på aluminiumbehållaren och täcktes med vävnad som åtdragits med lite tejp. Därefter placerades de skruvade behållarna i en Labconco FreeZone frystork (Labconco, Kansas City, MO, USA) utrustad med en bricktork. Temperaturen och vakuumtrycket inställdes på -10 °C, 0,350 Torr under de första 2 timmarna och 0 °C och 0,120 Torr under de återstående 22 timmarna av de 24 timmarna för att erhålla torra insulin-nanopartiklar.
Buchi Mini Spray Dryer B-290 (BÜCHI, Flawil, Schweiz) användes för att generera inkapslat insulin. De valda torkparametrarna var: temperatur 100 °C, matningsflöde 3 L/min och gasflöde 4 L/min.
Insulin-nanopartiklar före och efter dehydrering karakteriserades med hjälp av FTIR-ATR-spektroskopi. Dehydrerade nanopartiklar såväl som fritt insulin och kitosan analyserades med hjälp av en Spectrum 100 FTIR-spektrofotometer (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA) utrustad med ett universellt ATR-provtagningstillbehör (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA). Signalmedelvärden erhölls från 16 skanningar med en upplösning på 4 cm2 i frekvensområdet 4000-600 cm2.
Morfologin hos torra insulin-nanopartiklar utvärderades med hjälp av SEM-bilder av frystorkade och spraytorkade insulin-nanopartiklar tagna med ett Helios NanoLab 650 Focused Ion Beam-Scanning Electron Microscope (FIB-SEM) (FEI, Hillsboro, Oregon, USA). Den huvudsakliga parametern som användes var spänning 5 keV och ström 30 mA.
Alla dehydrerade insulin-NP:er löstes upp igen i dehydrerat vatten. Partikelstorlek, PDI, EE och LC testades igen med samma metod som nämnts tidigare för att bedöma deras kvalitet efter dehydrering. Stabiliteten hos anhydroinsulin-NP:er mättes också genom att testa NP:ernas egenskaper efter långvarig lagring. I denna studie förvarades alla NP:er efter dehydrering i kylskåp i tre månader. Efter tre månaders lagring testades NP:erna med avseende på morfologisk partikelstorlek, PDI, EE och LC.
Lös upp 5 ml rekonstituerade nanopartiklar i 45 ml innehållande simulerad magvätska (pH 1,2, innehållande 1 % pepsin), tarmvätska (pH 6,8, innehållande 1 % trypsin) eller kymotrypsinlösning (100 g/ml, i fosfatbuffert, pH 7,8) för att utvärdera insulinets effektivitet för att skydda nanopartiklar efter uttorkning. De inkuberades vid 37 °C med en omrörningshastighet på 100 rpm. 500 μl av lösningen samlades in vid olika tidpunkter och insulinkoncentrationen bestämdes med HPLC.
Frisättningsbeteendet in vitro för nyberedda och dehydrerade insulin-nanopartiklar testades med dialyspåsemetoden (molekylviktsgräns 100 kDa, Spectra Por Inc.). Nyberedda och rekonstituerade torra nanopartiklar dialyserades i vätskor vid pH 2,5, pH 6,6 respektive pH 7,0 (0,1 M fosfatbuffrad saltlösning, PBS) för att simulera pH-miljön i magsäcken, tolvfingertarmen respektive övre tunntarmen. Alla prover inkuberades vid 37 °C med kontinuerlig skakning vid 200 rpm. Aspirera vätskan utanför 5 ml dialyspåsen vid följande tidpunkter: 0,5, 1, 2, 3, 4 och 6 timmar, och fyll omedelbart på volymen med färskt dialysat. Insulinkontaminering i vätskan analyserades med HPLC, och hastigheten för insulinfrisättning från nanopartiklarna beräknades utifrån förhållandet mellan fritt frisatt insulin och totalt insulin inkapslat i nanopartiklarna (ekvation 3).
Humana hepatocellulära karcinomcellinjer HepG2-celler odlades i plattor med 60 mm diameter med användning av Dulbeccos modifierade Eagle-medium (DMEM) innehållande 10 % fetalt bovint serum, 100 IE/ml penicillin och 100 μg/ml streptomycin29. Kulturerna hölls vid 37 °C, 95 % relativ fuktighet och 5 % CO2. För upptagsanalyser såddes HepG2-celler vid 1 × 10^5 celler/ml på ett 8-brunns Nunc Lab-Tek kammarglas-system (Thermo Fisher, NY, USA). För cytotoxicitetsanalyser såddes de i 96-brunnsplattor (Corning, NY, USA) med en densitet av 5 × 10^4 celler/ml.
MTT-analysen användes för att utvärdera cytotoxiciteten hos nyframställda och dehydrerade insulin-NP30. HepG2-celler såddes i 96-brunnsplattor med en densitet av 5 × 104 celler/ml och odlades i 7 dagar före testning. Insulin-NP späddes till olika koncentrationer (50 till 500 μg/ml) i odlingsmedium och administrerades sedan till cellerna. Efter 24 timmars inkubation tvättades cellerna 3 gånger med PBS och inkuberades med medium innehållande 0,5 mg/ml MTT i ytterligare 4 timmar. Cytotoxiciteten bedömdes genom att mäta den enzymatiska reduktionen av gult tetrazolium-MTT till lila formazan vid 570 nm med användning av en Tecan infinite M200 pro spektrofotometerplattläsare (Tecan, Männedorf, Schweiz).
Den cellulära upptagseffektiviteten hos NP testades med konfokal laserskanningsmikroskopi och flödescytometrianalys. Varje brunn i Nunc Lab-Tek kammarglassystemet behandlades med fritt FITC-insulin, FITC-insulinladdade NP och rekonstituerades 25 μg/ml dehydrerade FITC-insulin NP vid samma koncentration och inkuberades i 4 timmar. Cellerna tvättades 3 gånger med PBS och fixerades med 4% paraformaldehyd. Kärnor färgades med 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI). Insulinlokalisering observerades med ett Olympus FV1000 laserskannings-/tvåfoton-konfokalmikroskop (Olympus, Shinjuku City, Tokyo, Japan). För flödescytometrianalys tillsattes samma koncentrationer av 10 μg/ml fritt FITC-insulin, FITC-insulinladdade NP och återlösliga dehydrerade FITC-insulin NP till 96-brunnsplattor sådda med HepG2-celler och inkuberades i 4 timmar. Efter 4 timmars inkubation avlägsnades cellerna och tvättades 3 gånger med FBS. 5 × 104 celler per prov analyserades med en BD LSR II flödescytometer (BD, Franklin Lakes, New Jersey, USA).
Alla värden uttrycks som medelvärde ± standardavvikelse. Jämförelser mellan alla grupper utvärderades med hjälp av envägs-ANOVA eller t-test med IBM SPSS Statistics 26 för Mac (IBM, Endicott, New York, USA) och p < 0,05 ansågs statistiskt signifikant.
Denna studie visar flexibiliteten och förmågan hos spraytorkning att dehydrera tvärbundna kitosan/TPP/insulin-nanopartiklar med bättre rekonstitution jämfört med standardfrystorkningsmetoder som använder bulkmedel eller kryoskyddsmedel med högre belastningskapacitet. De optimerade insulin-nanopartiklarna gav en genomsnittlig partikelstorlek på 318 nm och en inkapslingseffektivitet på 99,4 %. SEM- och FTIR-resultat efter dehydrering visade att den sfäriska strukturen endast bibehölls i spraytorkade NP med och utan mannitol och frystorkade med mannitol, men frystorkade NP utan mannitol sönderdelades under dehydrering. I rekonstitutionsförmågastestet visade insulin-nanopartiklar spraytorkade utan mannitol den minsta genomsnittliga partikelstorleken och den högsta belastningen vid rekonstitution. Frisättningsbeteendet hos alla dessa dehydrerade NP visade att de frisattes snabbt i lösningar med pH = 2,5 och pH = 7, och mycket stabila i lösning med pH = 6,5. Jämfört med andra återupplösta dehydrerade NP, NP:erna Spraytorkade utan mannitol visade den snabbaste frisättningen. Detta resultat överensstämmer med det som observerades i den cellulära upptagsanalysen, eftersom spraytorkade nanopartiklar i frånvaro av mannitol nästan fullständigt bibehöll den cellulära upptagseffektiviteten hos nyframställda nanopartiklar. Dessa resultat tyder på att torra insulinnanopartiklar framställda genom mannitolfri spraytorkning är mest lämpade för vidare bearbetning till andra vattenfria doseringsformer, såsom orala tabletter eller bioadhesiva filmer.
På grund av problem med immateriella rättigheter är de datamängder som genererats och/eller analyserats under den aktuella studien inte offentligt tillgängliga, men kan erhållas från respektive författare på rimlig begäran.
Kagan, A. Typ 2-diabetes: sociala och vetenskapliga orsaker, medicinska komplikationer och konsekvenser för patienter och andra. (McFarlane, 2009).
Singh, AP, Guo, Y., Singh, A., Xie, W. & Jiang, P. Utvecklingen av insulininkapsling: är oral administrering nu möjlig? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Wong, CY, Al-Salami, H. & Dass, CR Nya framsteg inom orala insulinbelastade liposomedel för behandling av diabetes. Interpretation. J. Pharmacy. 549, 201–217 (2018).