Tack för att du besöker Nature.com. Den webbläsarversion du använder har begränsat CSS-stöd. För bästa resultat rekommenderar vi att du använder en nyare version av din webbläsare (eller inaktiverar kompatibilitetsläge i Internet Explorer). Under tiden, för att säkerställa fortsatt support, visar vi webbplatsen utan styling eller JavaScript.
Propionsyra (PPA) används för att studera rollen av mitokondriell dysfunktion vid neurologiska utvecklingsstörningar såsom autismspektrumstörning. PPA är känt för att störa mitokondriell biogenes, metabolism och omsättning. Effekterna av PPA på mitokondriell dynamik, fission och fusion är dock fortfarande problematiska på grund av den komplexa tidsmässiga naturen hos dessa mekanismer. Här använder vi kompletterande kvantitativa avbildningstekniker för att undersöka hur PPA påverkar mitokondriell ultrastruktur, morfologi och dynamik i neuronliknande SH-SY5Y-celler. PPA (5 mM) orsakade en signifikant minskning av mitokondriearea (p < 0,01), feretdiameter och omkrets (p < 0,05) och area 2 (p < 0,01). Mitokondriell händelselokaliseringsanalys visade en signifikant ökning (p < 0,05) av fissions- och fusionshändelser, vilket bibehöll integriteten hos det mitokondriella nätverket under stressförhållanden. Dessutom minskade mRNA-uttrycket av cMYC (p < 0,0001), NRF1 (p < 0,01), TFAM (p < 0,05), STOML2 (p < 0,0001) och OPA1 (p < 0,05) signifikant. 01). Detta illustrerar ombyggnaden av mitokondriell morfologi, biogenes och dynamik för att bibehålla funktion under stressförhållanden. Våra data ger ny insikt i effekterna av PPA på mitokondriell dynamik och belyser nyttan av avbildningstekniker för att studera de komplexa regleringsmekanismer som är involverade i mitokondriella stressreaktioner.
Mitokondrier är integrerade deltagare i en mängd olika cellulära funktioner utöver deras typiska roller i energiproduktion och biosyntes. Mitokondriell metabolism är en viktig regulator av kalciumsignalering, metabolisk och redoxhomeostas, inflammatorisk signalering, epigenetiska modifieringar, cellproliferation, differentiering och programmerad celldöd1. I synnerhet är mitokondriell metabolism avgörande för neuronal utveckling, överlevnad och funktion och är i stor utsträckning involverad i olika manifestationer av neuropatologi2,3,4.
Under det senaste decenniet har metabolisk status framstått som en central regulator för neurogenes, differentiering, mognad och plasticitet5,6. Nyligen har mitokondriell morfologi och dynamik blivit särskilt viktiga komponenter i mitos, en dynamisk process som upprätthåller en pool av friska mitokondrier i cellerna. Mitokondriell dynamik regleras av komplexa, ömsesidigt beroende vägar som sträcker sig från mitokondriell biogenes och bioenergetik till mitokondriell fission, fusion, transport och clearance7,8. Störningar i någon av dessa integrativa mekanismer försämrar upprätthållandet av friska mitokondriella nätverk och har djupgående funktionella konsekvenser för neurologisk utveckling9,10. Faktum är att dysreglering av mitokondriell dynamik observeras vid många psykiatriska, neurodegenerativa och neurologiska utvecklingsstörningar, inklusive autismspektrumstörningar (ASD)11,12.
ASD är en heterogen neurologisk utvecklingsstörning med en komplex genetisk och epigenetisk arkitektur. Ärftligheten hos ASD är obestridd, men den underliggande molekylära etiologin är fortfarande dåligt förstådd. Ackumulering av data från prekliniska modeller, kliniska studier och multiomiska molekylära datamängder ger ökande bevis på mitokondriell dysfunktion vid ASD13,14. Vi utförde tidigare en genomomfattande DNA-metyleringsscreening i en kohort av patienter med ASD och identifierade differentiellt metylerade gener klustrade längs mitokondriella metaboliska vägar15. Vi rapporterade senare differentiell metylering av centrala regulatorer av mitokondriell biogenes och dynamik, vilket var associerat med ökat mtDNA-kopieantal och förändrad urinmetabolisk profil vid ASD16. Våra data ger ökande bevis för att mitokondriell dynamik och homeostas spelar en central roll i patofysiologin vid ASD. Därför är det ett viktigt mål för pågående forskning om neurologiska sjukdomar som kännetecknas av sekundär mitokondriell dysfunktion att förbättra den mekanistiska förståelsen av sambandet mellan mitokondriell dynamik, morfologi och funktion.
Molekylära tekniker används ofta för att studera specifika geners roll i mitokondriella stressreaktioner. Denna metod kan dock begränsas av den mångfacetterade och tidsmässiga naturen hos mitotiska kontrollmekanismer. Dessutom är differentiellt uttryck av mitokondriella gener en indirekt indikator på funktionella förändringar, särskilt eftersom endast ett begränsat antal gener vanligtvis analyseras. Därför har mer direkta metoder för att studera mitokondriell funktion och bioenergetik föreslagits17. Mitokondriell morfologi är nära besläktad med mitokondriell dynamik. Mitokondriell form, konnektivitet och struktur är avgörande för energiproduktion och mitokondriell och cellöverlevnad5,18. Dessutom fokuserar de olika komponenterna i mitos på förändringar i mitokondriell morfologi, vilket kan tjäna som användbara slutpunkter för mitokondriell dysfunktion och ge en grund för efterföljande mekanistiska studier.
Mitokondriell morfologi kan observeras direkt med hjälp av transmissionselektronmikroskopi (TEM), vilket möjliggör detaljerade studier av cellulär ultrastruktur. TEM visualiserar direkt morfologin, formen och strukturen hos mitokondriella cristae vid upplösningen av individuella mitokondrier, snarare än att enbart förlita sig på gentranskription, proteinuttryck eller mitokondriella funktionella parametrar i cellpopulationer17,19,20. Dessutom underlättar TEM studier av interaktioner mellan mitokondrier och andra organeller, såsom endoplasmatiskt retikulum och autofagosomer, vilka spelar nyckelroller i mitokondriell funktion och homeostas21,22. Detta gör TEM till en bra utgångspunkt för att studera mitokondriell dysfunktion innan man fokuserar på specifika vägar eller gener. I takt med att mitokondriell funktion blir alltmer relevant för neuropatologi finns det ett tydligt behov av att kunna direkt och kvantitativt studera mitokondriell morfologi och dynamik i in vitro neuronala modeller.
I den här artikeln undersöker vi mitokondriell dynamik i en neuronal modell av mitokondriell dysfunktion vid autismspektrumstörning. Vi har tidigare rapporterat differentiell metylering av propionyl-CoA-karboxylas beta (PCCB) i ASD15, en subenhet av det mitokondriella propionyl-CoA-karboxylasenzymet PCC. Dysreglering av PCC är känt för att orsaka toxisk ansamling av propionylderivat, inklusive propionsyra (PPA)23,24,25. PPA har visat sig störa neuronal metabolism och förändra beteende in vivo och är en etablerad djurmodell för att studera neurologiska utvecklingsmekanismer involverade i ASD26,27,28. Dessutom har PPA rapporterats störa mitokondriell membranpotential, biogenes och respiration in vitro och har använts i stor utsträckning för att modellera mitokondriell dysfunktion i neuroner29,30. Emellertid är effekten av PPA-inducerad mitokondriell dysfunktion på mitokondriell morfologi och dynamik fortfarande dåligt förstådd.
Denna studie använder komplementära avbildningstekniker för att kvantifiera effekterna av PPA på mitokondriell morfologi, dynamik och funktion i SH-SY5Y-celler. Först utvecklade vi en TEM-metod för att visualisera förändringar i mitokondriell morfologi och ultrastruktur17,31,32. Med tanke på mitokondriernas dynamiska natur33 använde vi även mitokondriell händelselokaliseringsanalys (MEL) för att kvantifiera förändringar i balansen mellan fissions- och fusionshändelser, mitokondriellt antal och volym under PPA-stress. Slutligen undersökte vi om mitokondriell morfologi och dynamik är associerade med förändringar i uttrycket av gener involverade i biogenes, fission och fusion. Sammantaget illustrerar våra data utmaningen att belysa komplexiteten i de mekanismer som reglerar mitokondriell dynamik. Vi belyser nyttan av TEM för att studera mitokondriell morfologi som en mätbar konvergent slutpunkt för mitos i SH-SY5Y-celler. Dessutom belyser vi att TEM-data ger den rikaste informationen i kombination med avbildningstekniker som också fångar dynamiska händelser som svar på metabolisk stress. Ytterligare karakterisering av de molekylära regleringsmekanismer som stöder neuronal cellmitos kan ge viktig insikt i den mitokondriella komponenten i nervsystemet och neurodegenerativa sjukdomar.
För att inducera mitokondriell stress behandlades SH-SY5Y-celler med PPA med användning av 3 mM och 5 mM natriumpropionat (NaP). Före TEM utsattes proverna för kryogen provberedning med högtrycksfrysning och frysning (Fig. 1a). Vi utvecklade en automatiserad pipeline för mitokondriell bildanalys för att mäta åtta morfologiska parametrar av mitokondriepopulationer över tre biologiska replikat. Vi fann att PPA-behandling signifikant förändrade fyra parametrar: area 2, area, perimeter och Feret-diameter (Fig. 1b–e). Area 2 minskade signifikant med både 3 mM och 5 mM PPA-behandling (p = 0,0183 respektive p = 0,002) (Fig. 1b), medan area (p = 0,003), perimeter (p = 0,0106) och Feret-diameter alla minskade signifikant. Det fanns en signifikant minskning (p = 0,0172) i 5 mM-behandlingsgruppen jämfört med kontrollgruppen (Fig. 1c–e). Signifikanta minskningar av area och omkrets visade att celler behandlade med 5 mM PPA hade mindre, mer rundade mitokondrier, och att dessa mitokondrier var mindre förlängda än de i kontrollcellerna. Detta överensstämmer också med en signifikant minskning av Feret-diametern, en oberoende parameter som indikerar en minskning av det största avståndet mellan partikelkanterna. Förändringar i cristéernas ultrastruktur observerades: cristéerna blev mindre uttalade under påverkan av PPA-stress (Fig. 1a, panel B). Emellertid återspeglade inte alla bilder tydligt cristéernas ultrastruktur, så en kvantitativ analys av dessa förändringar utfördes inte. Dessa TEM-data kan återspegla tre möjliga scenarier: (1) PPA förstärker fission eller hämmar fusion, vilket får befintliga mitokondrier att krympa i storlek; (2) förbättrad biogenes skapar nya, mindre mitokondrier eller (3) inducerar båda mekanismerna samtidigt. Även om dessa förhållanden inte kan särskiljas med TEM, indikerar signifikanta morfologiska förändringar förändringar i mitokondriell homeostas och dynamik under PPA-stress. Vi undersökte därefter ytterligare parametrar för att ytterligare karakterisera denna dynamik och de potentiella mekanismerna som ligger bakom den.
Propionsyra (PPA) omformar mitokondriemorfologin. (a) Representativa transmissionselektronmikroskopi (TEM) bilder som visar att mitokondriestorleken minskar och mitokondrierna blir mindre och mer rundade med ökande PPA-behandling; 0 mM (obehandlad), 3 mM respektive 5 mM. Röda pilar indikerar mitokondrier. (b–e) SH-SY5Y-celler behandlade med PPA i 24 timmar bereddes för TEM och resultaten analyserades med Fiji/ImageJ. Fyra av de åtta parametrarna visade signifikanta skillnader mellan kontrollceller (obehandlade, 0 mM PPA) och behandlade celler (3 mM och 5 mM PPA). (b) Region 2, (c) Area, (d) Perimeter, (e) Illerdiameter. Envägsvariansanalys (kontroll kontra behandling) och Dunnetts multipla jämförelsetest användes för att bestämma signifikanta skillnader (p < 0,05). Datapunkter representerar det genomsnittliga mitokondriella värdet för varje enskild cell, och felstaplar representerar medelvärdet ± SEM. Visade data representerar n = 3, minst 24 celler per replikat; totalt 266 bilder analyserades; * indikerar p < 0,05, ** indikerar p < 0,01.
För att ytterligare karakterisera hur mitokondriedynamik svarar på PPA färgade vi mitokondrier med tetrametylrhodaminetylester (TMRE) och använde time-lapse-mikroskopi och MEL-analys för att lokalisera och kvantifiera mitokondrier efter 24 timmar vid 3 och 5 mM PPA. Behandling av fissions- och fusionshändelser. (Fig. 2a). Efter MEL-analys analyserades mitokondrierna ytterligare för att kvantifiera antalet mitokondriella strukturer och deras genomsnittliga volym. Vi observerade en liten men signifikant ökning av antalet fissionshändelser som inträffade vid 3 mM [4,9 ± 0,3 (p < 0,05)] jämfört med fissions- [5,6 ± 0,3 (p < 0,05))] och fusions- [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] 0,05)] <0,05)] ökade signifikant vid 5 mM jämfört med kontroll (Fig. 3b). Antalet mitokondrier ökade signifikant vid både 3 [32,6 ± 2,1 (p < 0,05)] och 5 mM [34,1 ± 2,2 (p < 0,05)] (Fig. 3c), medan den genomsnittliga volymen för varje mitokondriell struktur förblev oförändrad (Fig. 3c). 3d). Sammantaget tyder detta på att ombyggnad av mitokondriedynamik fungerar som ett kompensatoriskt svar som framgångsrikt upprätthåller integriteten hos det mitokondriella nätverket. Ökningen i antalet fissionshändelser vid 3 mM PPA tyder på att ökningen av antalet mitokondrier delvis beror på mitokondriell fission, men med tanke på att den genomsnittliga mitokondrievolymen förblir i huvudsak oförändrad kan biogenes inte uteslutas som ett ytterligare kompensatoriskt svar. Dessa data överensstämmer dock med de mindre, runda mitokondriella strukturerna som observerats med TEM och visar också signifikanta förändringar i mitokondriedynamik inducerad av PPA.
Propionsyra (PPA) inducerar dynamisk mitokondriell ombyggnad för att bibehålla nätverkets integritet. SH-SY5Y-celler odlades, behandlades med 3 och 5 mM PPA i 24 timmar och färgades med TMRE och Hoechst 33342 följt av MEL-analys. (a) Representativa time-lapse-mikroskopibilder som visar färg och binära maximalintensitetsprojektioner vid tidpunkt 2 (t2) för varje tillstånd. Valda regioner som anges i varje binär bild är förstärkta och visas i 3D vid tre olika tidsramar (t1-t3) för att illustrera dynamiken över tid; fusionshändelser är markerade i grönt; fissionshändelser är markerade i grönt. Visas i rött. (b) Genomsnittligt antal dynamiska händelser per tillstånd. (c) Genomsnittligt antal mitokondriestrukturer per cell. (d) Genomsnittlig volym (µm3) för varje mitokondriestruktur per cell. Data som visas är representativa för n = 15 celler per behandlingsgrupp. Felstaplarna som visas representerar medelvärde ± SEM, skalstapel = 10 μm, * p < 0,05.
Propionsyra (PPA) orsakar transkriptionell suppression av gener associerade med mitokondriell dynamik. SH-SY5Y-celler behandlades med 3 och 5 mM PPA i 24 timmar. Relativ genkvantifiering utfördes med RT-qPCR och normaliserades till B2M. Mitokondriella biogenesgener (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 och (d) NFE2L2. Mitokondriella fusions- och fissionsgener (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 och (i) DRP1. Signifikanta skillnader (p < 0,05) testades med envägs ANOVA (kontroll vs. behandling) och Dunnetts multipla jämförelsetest: * indikerar p < 0,05, ** indikerar p < 0,01 och **** indikerar p < 0,0001. Staplarna representerar medeluttryck ± SEM. Visade data representerar biologiska replikat av n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) och n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1).
Data från TEM- och MEL-analyser indikerar tillsammans att PPA förändrar mitokondriell morfologi och dynamik. Dessa avbildningstekniker ger dock inte insikt i de underliggande mekanismerna som driver dessa processer. Vi undersökte därför mRNA-uttrycket av nio viktiga regulatorer av mitokondriell dynamik, biogenes och mitos som svar på PPA-behandling. Vi kvantifierade cellmyelom-onkogen (cMYC), nukleär respiratorisk faktor (NRF1), mitokondriell transkriptionsfaktor 1 (TFAM), NFE2-liknande transkriptionsfaktor BZIP (NFE2L2), gastrinliknande protein 2 (STOML2), synnervsatrofi 1 (OPA1), Mitofusin 1 (MFN1), Mitofusin 2 (MFN2) och dynaminrelaterat protein 1 (DRP1) efter 24 timmars behandling med 3 mM och 5 mM PPA. Vi observerade 3 mM (p = 0,0053, p = 0,0415 respektive p < 0,0001) och 5 mM (p = 0,0031, p = 0,0233, p < 0,0001) PPA-behandling. (Fig. 3a–c). Minskningen av mRNA-uttryck var dosberoende: uttrycket av cMYC, NRF1 och TFAM minskade med 5,7, 2,6 respektive 1,9 gånger vid 3 mM, och med 11,2, 3 respektive 2,2 gånger vid 5 mM. Däremot förändrades inte den centrala redoxbiogenesgenen NFE2L2 vid någon koncentration av PPA, även om en liknande dosberoende trend av minskat uttryck observerades (Fig. 3d).
Vi undersökte också uttrycket av klassiska gener involverade i regleringen av fission och fusion. STOML2 tros vara involverat i fusion, mitofagi och biogenes, och dess uttryck minskade signifikant (p < 0,0001) med 3 mM (2,4-faldig förändring) och 5 mM (2,8-faldig förändring) PPA (Fig. 1). 3d). På liknande sätt minskade OPA1-fusionsgenuttrycket vid 3 mM (1,6-faldig förändring) och 5 mM (1,9-faldig förändring) PPA (p = 0,006 respektive p = 0,0024) (Fig. 3f). Vi fann dock inga signifikanta skillnader i uttrycket av fusionsgenerna MFN1, MFN2 eller fissionsgenen DRP1 under 24-timmars PPA-stress (Fig. 3g–i). Dessutom fann vi att nivåerna av fyra fusions- och fissionsproteiner (OPA1, MFN1, MFN2 och DRP1) inte förändrades under samma förhållanden (Fig. 4a–d). Det är viktigt att notera att dessa data återspeglar en enda tidpunkt och kanske inte återspeglar förändringar i proteinuttryck eller aktivitetsnivåer under de tidiga stadierna av PPA-stress. Signifikanta minskningar av uttrycket av cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 och OPA1 indikerar dock signifikant transkriptionell dysreglering av mitokondriell metabolism, biogenes och dynamik. Dessutom belyser dessa data nyttan av avbildningstekniker för att direkt studera sluttillståndsförändringar i mitokondriell funktion.
Fusions- och fissionsfaktorproteinnivåerna förändrades inte efter behandling med propionsyra (PPA). SH-SY5Y-celler behandlades med 3 och 5 mM PPA i 24 timmar. Proteinnivåerna kvantifierades genom Western blot-analys, och expressionsnivåerna normaliserades till totalt protein. Genomsnittligt proteinuttryck och representativa Western blots av mål- och totalt protein visas. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Staplarna representerar medelvärde ± SEM, och visade data är representativa för n = 3 biologiska replikat. Multipla jämförelser (p < 0,05) utfördes med hjälp av envägsvariansanalys och Dunnetts test. Den ursprungliga gelen och blotten visas i figur S1.
Mitokondriell dysfunktion är associerad med multisystemsjukdomar, allt från metabola, hjärt-kärl- och muskelsjukdomar till neurologiska sjukdomar1,10. Många neurodegenerativa och neurodegenerativa sjukdomar är associerade med mitokondriell dysfunktion, vilket belyser vikten av dessa organeller under hela hjärnans livslängd. Dessa sjukdomar inkluderar Parkinsons sjukdom, Alzheimers sjukdom och ASD3,4,18. Det är dock svårt att få tillgång till hjärnvävnad för att studera dessa sjukdomar, särskilt på mekanistisk nivå, vilket gör cellulära modellsystem till ett nödvändigt alternativ. I denna studie använder vi ett cellulärt modellsystem med PPA-behandlade SH-SY5Y-celler för att återskapa den mitokondrielle dysfunktion som observerats vid neuronala sjukdomar, särskilt autismspektrumstörningar. Att använda denna PPA-modell för att studera mitokondriell dynamik i neuroner kan ge insikt i etiologin för ASD.
Vi undersökte möjligheten att använda TEM för att se förändringar i mitokondriell morfologi. Det är viktigt att notera att TEM måste användas korrekt för att maximera dess effektivitet. Beredning av kryoprover möjliggör bättre bevarande av neuronala strukturer genom att samtidigt fixera cellulära komponenter och minska bildandet av artefakter34. I överensstämmelse med detta observerade vi att neuronliknande SH-SY5Y-celler hade intakta subcellulära organeller och förlängda mitokondrier (Fig. 1a). Detta belyser nyttan av kryogena beredningstekniker för att studera mitokondriell morfologi i neuronala cellmodeller. Även om kvantitativa mätningar är avgörande för objektiv analys av TEM-data, finns det fortfarande ingen konsensus om vilka specifika parametrar som bör mätas för att bekräfta mitokondriella morfologiska förändringar. Baserat på ett stort antal studier som kvantitativt har undersökt mitokondriell morfologi17,31,32, utvecklade vi en automatiserad pipeline för mitokondriell bildanalys som mäter åtta morfologiska parametrar, nämligen: area, area2, bildförhållande, omkrets, cirkularitet, grad, Ferret-diameter och rundhet.
Bland dem minskade PPA signifikant area 2, area, omkrets och Feret-diameter (Fig. 1b–e). Detta visade att mitokondrier blev mindre och mer rundade, vilket överensstämmer med tidigare studier som visat en minskning av mitokondriearean efter 72 timmar av PPA30-inducerad mitokondriell stress. Dessa morfologiska egenskaper kan indikera mitokondriell fission, en nödvändig process för att sekvestera skadade komponenter från det mitokondriella nätverket för att främja deras nedbrytning genom mitofagi35,36,37. Å andra sidan kan minskningen av genomsnittlig mitokondriestorlek vara förknippad med ökad biogenes, vilket resulterar i bildandet av små begynnande mitokondrier. Ökad fission eller biogenes representerar ett kompensatoriskt svar för att upprätthålla mitos mot mitokondriell stress. Minskad mitokondriell tillväxt, försämrad fusion eller andra tillstånd kan dock inte uteslutas.
Även om de högupplösta bilderna som skapas med TEM möjliggör bestämning av morfologiska egenskaper på nivån av individuella mitokondrier, producerar denna metod tvådimensionella ögonblicksbilder vid en enda tidpunkt. För att studera dynamiska svar på metabolisk stress färgade vi mitokondrier med TMRE och använde time-lapse-mikroskopi med MEL-analys, vilket möjliggör högkapacitets 3D-visualisering av förändringar i det mitokondriella nätverket över tid33,38. Vi observerade subtila men signifikanta förändringar i mitokondriedynamiken under PPA-stress (Fig. 2). Vid 3 mM ökade antalet fissionshändelser signifikant, medan fusionshändelser förblev desamma som i kontrollen. En ökning av antalet både fissions- och fusionshändelser observerades vid 5 mM PPA, men dessa förändringar var ungefär proportionella, vilket tyder på att fissions- och fusionskinetiken når jämvikt vid högre koncentrationer (Fig. 2b). Den genomsnittliga mitokondrievolymen förblev oförändrad vid både 3 och 5 mM PPA, vilket indikerar att det mitokondriella nätverkets integritet bevarades (Fig. 2d). Detta återspeglar dynamiska mitokondriella nätverks förmåga att reagera på mild metabolisk stress för att effektivt upprätthålla homeostas utan att orsaka nätverksfragmentering. Vid 3 mM PPA är ökningen av fission tillräcklig för att främja övergången till en ny jämvikt, men mer djupgående kinetisk ombyggnad krävs som svar på stress inducerad av högre koncentrationer av PPA.
Antalet mitokondrier ökade vid båda PPA-stresskoncentrationerna, men den genomsnittliga mitokondrievolymen förändrades inte signifikant (Fig. 2c). Detta kan bero på ökad biogenes eller ökad delning; men i avsaknad av en signifikant minskning av den genomsnittliga mitokondrievolymen är det mer troligt att biosyntesen ökar. Uppgifterna i figur 2 stöder dock förekomsten av två kompensationsmekanismer: en ökning av antalet fissionshändelser, vilket överensstämmer med uppreglering av mitokondriell fission, och en ökning av antalet händelser, vilket överensstämmer med mitokondriell biogenes. I slutändan kan dynamisk kompensation för mild stress bestå av samtidiga processer som involverar fission, fusion, biogenes och mitofagi. Även om tidigare författare har visat att PPA förstärker mitos30,39 och mitofagi29, ger vi bevis för ombyggnad av mitokondriell fissions- och fusionsdynamik som svar på PPA. Dessa data bekräftar de morfologiska förändringar som observerats av TEM och ger ytterligare insikt i de mekanismer som är associerade med PPA-inducerad mitokondriell dysfunktion.
Eftersom varken TEM- eller MEL-analys gav direkta bevis för de genreglerande mekanismer som ligger bakom de observerade morfologiska förändringarna, undersökte vi RNA-uttrycket av gener involverade i mitokondriell metabolism, biogenes och dynamik. cMYC-proto-onkogenen är en transkriptionsfaktor involverad i regleringen av mitokondrier, glykolys, aminosyra- och fettsyrametabolism40. Dessutom är cMYC känt för att reglera uttrycket av nästan 600 mitokondriella gener involverade i mitokondriell transkription, translation och komplexmontering, inklusive NRF1 och TFAM41. NRF1 och TFAM är två centrala regulatorer av mitos, som verkar nedströms PGC-1α för att aktivera mtDNA-replikation. Denna signalväg aktiveras av cAMP- och AMPK-signalering och är känslig för energiförbrukning och metabolisk stress. Vi undersökte också NFE2L2, en redoxregulator av mitokondriell biogenes, för att avgöra om effekterna av PPA kan medieras av oxidativ stress.
Även om NFE2L2-uttrycket förblev oförändrat, fann vi en konsekvent dosberoende minskning av uttrycket av cMYC, NRF1 och TFAM efter 24 timmars behandling med 3 mM och 5 mM PPA (Fig. 3a–c). Nedreglering av cMYC-uttryck har tidigare rapporterats som ett svar på mitokondriell stress42, och omvänt kan nedreglering av cMYC-uttryck orsaka mitokondriell dysfunktion genom att ombygga mitokondriell metabolism, nätverksanslutning och membranpolarisering43. Intressant nog är cMYC också involverat i regleringen av mitokondriell fission och fusion42,43 och är känt för att öka DRP1-fosforylering och mitokondriell lokalisering under celldelning44, samt mediera mitokondriell morfologisk ombyggnad i neuronala stamceller45. Faktum är att cMYC-bristfälliga fibroblaster uppvisar minskad mitokondriestorlek, vilket överensstämmer med förändringar inducerade av PPA43-stress. Dessa data illustrerar ett intressant men ännu oklart samband mellan cMYC och mitokondriedynamik, vilket ger ett intressant mål för framtida studier av PPA-stressinducerad ombyggnad.
Minskningen av NRF1 och TFAM överensstämmer med cMYC:s roll som en viktig transkriptionsaktivator. Dessa data överensstämmer också med tidigare studier i humana koloncancerceller som visar att PPA minskade NRF1 mRNA-uttryck vid 22 timmar, vilket var associerat med ATP-utarmning och ökat ROS46. Dessa författare rapporterade också att TFAM-uttrycket ökade vid 8,5 timmar men återgick till baslinjenivåerna vid 22 timmar. Däremot visade Kim et al. (2019) att TFAM mRNA-uttrycket minskade signifikant efter 4 timmars PPA-stress i SH-SY5Y-celler; efter 72 timmar ökade dock TFAM-proteinuttrycket signifikant och antalet mtDNA-kopier ökade signifikant. Således utesluter minskningen av antalet mitokondriella biogenesgener som vi observerade efter 24 timmar inte möjligheten att ökningen av antalet mitokondrier är associerad med aktivering av biogenes vid tidigare tidpunkter. Tidigare studier har visat att PPA signifikant uppreglerar PGC-1α mRNA och protein i SH-SY5Y-celler vid 4 timmar och 30 minuter, medan propionsyra förstärker mitokondriell biogenes i kalvhepatocyter via PGC-1α vid 12 timmar och 39 minuter. Intressant nog är PGC-1α inte bara en direkt transkriptionsregulator av NRF1 och TFAM, utan har också visat sig reglera aktiviteten hos MFN2 och DRP1 genom att reglera fission och fusion47. Sammantaget belyser detta den nära kopplingen mellan mekanismer som reglerar mitokondriella kompensationsresponser inducerade av PPA. Dessutom återspeglar våra data signifikant dysreglering av transkriptionsreglering av biogenes och metabolism under PPA-stress.
STOML2-, OPA1-, MFN1-, MFN2- och DRP1-generna är bland de centrala regulatorerna av mitokondriell fission, fusion och dynamik37,48,49. Det finns många andra gener involverade i mitokondriell dynamik, men STOML2, OPA1 och MFN2 har tidigare visat sig vara differentiellt metylerade i ASD-kohorter,16 och flera oberoende studier har rapporterat förändringar i dessa transkriptionsfaktorer som svar på mitokondriell stress50,51.52. Uttrycket av både OPA1 och STOML2 minskade signifikant genom 3 mM och 5 mM PPA-behandling (Fig. 3e, f). OPA1 är en av de klassiska regulatorerna av mitokondriell fusion genom direkt interaktion med MFN1 och 2 och spelar en roll i cristae-ombyggnad och mitokondriell morfologi53. Den exakta rollen för STOML2 i mitokondriell dynamik är fortfarande oklar, men bevis tyder på att det spelar en roll i mitokondriell fusion, biogenes och mitofagi.
STOML2 är involverat i att upprätthålla mitokondriell respiratorisk koppling och bildandet av respiratoriska kedjekomplex54,55 och har visat sig djupt förändra cancercellers metaboliska egenskaper56. Studier har visat att STOML2 främjar mitokondriell membranpotential och biogenes genom interaktion med BAN och kardiolipin 55, 57, 58. Dessutom har oberoende studier visat att interaktionen mellan STOML2 och PINK1 reglerar mitofagi59,60. Det är värt att notera att STOML2 har rapporterats interagera direkt med och stabilisera MFN2 och även spela en viktig roll i att stabilisera långa OPA1-isoformer genom att hämma proteaset som är ansvarigt för OPA1-nedbrytning53,61,62. Minskningen av STOML2-uttryck som observerats i PPA-reaktioner kan göra dessa fusionsproteiner mer mottagliga för nedbrytning genom ubiquitin- och proteasomberoende vägar48. Även om den exakta rollen för STOML2 och OPA1 i det dynamiska svaret på PPA är oklar, kan minskat uttryck av dessa fusionsgener (Figur 3) störa balansen mellan fission och fusion och leda till minskad mitokondriestorlek (Figur 3).1).
Å andra sidan förblev OPA1-proteinuttrycket oförändrat efter 24 timmar, medan mRNA- och proteinnivåerna av MFN1, MFN2 eller DRP1 inte förändrades signifikant efter PPA-behandling (Fig. 3g-i, Fig. 4). Detta kan indikera att det inte finns några förändringar i regleringen av dessa faktorer involverade i mitokondriell fusion och fission. Det är dock värt att notera att var och en av dessa fyra gener också regleras av posttranskriptionella modifieringar (PTM) som kontrollerar proteinaktivitet. OPA1 har åtta alternativa splitsningsvarianter som klyvs proteolytiskt i mitokondrier för att producera två distinkta isoformer 63. Balansen mellan långa och korta isoformer avgör slutligen OPA1:s roll i mitokondriell fusion och upprätthållandet av det mitokondriella nätverket 64. DRP1-aktivitet regleras av kalcium/kalmodulinberoende proteinkinas II (CaMKII)-fosforylering, medan DRP1-nedbrytning regleras av ubiquitinering och SUMOylering 65. Slutligen är både DRP1 och MFN1/2 GTPaser, så aktiviteten kan påverkas av hastigheten för GTP-produktion i mitokondrier 66. Därför, även om uttrycket av dessa proteiner förblir konstant, kanske detta inte återspeglar oförändrad proteinaktivitet eller lokalisering 67,68. Faktum är att befintliga PTM-proteinrepertoarer ofta fungerar som den första försvarslinjen som ansvarar för att mediera akuta stressreaktioner. I närvaro av måttlig metabolisk stress i vår modell är det troligt att PTM främjar ökad aktivitet av fusions- och fissionsproteiner för att tillräckligt återställa mitokondrieintegriteten utan att kräva ytterligare aktivering av dessa gener på mRNA- eller proteinnivå.
Sammantaget belyser ovanstående data den komplexa och tidsberoende regleringen av mitokondriemorfologi och utmaningarna med att belysa dessa mekanismer. För att studera genuttryck är det först nödvändigt att identifiera specifika målgener i signalvägen. Våra data visar dock att gener i samma signalväg inte svarar på samma sätt på samma stress. Faktum är att tidigare studier har visat att olika gener i samma signalväg kan uppvisa olika tidsmässiga responsprofiler30,46. Dessutom finns det komplexa posttranskriptionella mekanismer som stör sambandet mellan transkription och genfunktion. Proteomstudier kan ge insikt i effekten av PTM och proteinfunktion, men de medför också utmaningar, inklusive metoder med låg genomströmning, höga signal-brusförhållanden och dålig upplösning.
I detta sammanhang har studier av mitokondriell morfologi med hjälp av TEM och MEL stor potential att ta itu med grundläggande frågor om sambandet mellan mitokondriell dynamik och funktion och hur detta påverkar sjukdomen. Viktigast av allt är att TEM tillhandahåller en direkt metod för att mäta mitokondriell morfologi som en konvergent slutpunkt för mitokondriell dysfunktion och dynamik51. MEL tillhandahåller också en direkt metod för att visualisera fissions- och fusionshändelser i en tredimensionell cellulär miljö, vilket möjliggör kvantifiering av dynamisk mitokondriell ombyggnad även i frånvaro av förändringar i genuttryck33. Här belyser vi nyttan av mitokondriella avbildningstekniker vid sekundära mitokondriella sjukdomar. Dessa sjukdomar kännetecknas vanligtvis av kronisk mild metabolisk stress som kännetecknas av subtil ombyggnad av mitokondriella nätverk snarare än akut mitokondriell skada. Emellertid har den mitokondriella kompensation som krävs för att upprätthålla mitos under kronisk stress djupgående funktionella konsekvenser. I samband med neurovetenskap kan en bättre förståelse av dessa kompensationsmekanismer ge viktig information om den pleiotropa neuropatologin som är associerad med mitokondriell dysfunktion.
I slutändan belyser våra data nyttan av avbildningstekniker för att förstå de funktionella konsekvenserna av de komplexa interaktionerna mellan genuttryck, proteinmodifieringar och proteinaktivitet som kontrollerar neuronal mitokondriedynamik. Vi använde PPA för att modellera mitokondriell dysfunktion i en neuronal cellmodell för att få insikt i den mitokondriella komponenten av ASD. SH-SY5Y-celler behandlade med PPA uppvisade förändringar i mitokondriell morfologi: mitokondrier blev små och runda, och cristae var dåligt definierade när de observerades med TEM. MEL-analys visar att dessa förändringar sker samtidigt med en ökning av fissions- och fusionshändelser för att upprätthålla det mitokondriella nätverket som svar på mild metabolisk stress. Dessutom stör PPA signifikant den transkriptionella regleringen av mitokondriell metabolism och homeostas. Vi identifierade cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 och OPA1 som viktiga mitokondriella regulatorer som störs av PPA-stress och kan spela en roll i att mediera PPA-inducerade förändringar i mitokondriell morfologi och funktion. Framtida studier behövs för att bättre karakterisera PPA-inducerade tidsmässiga förändringar i genuttryck och proteinaktivitet, lokalisering och posttranslationella modifieringar. Våra data belyser komplexiteten och det ömsesidiga beroendet mellan de regleringsmekanismer som medierar det mitokondriella stressresponset och visar nyttan av TEM och andra avbildningstekniker för mer riktade mekanistiska studier.
Cellinjen SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) köptes från Sigma-Aldrich. SH-SY5Y-celler odlades i Dulbeccos modifierade Eagle's medium/F-12 näringsblandning (DMEM/F-12) och L-glutamin (SC09411, ScienCell) i 25 cm2-kolvar kompletterade med 20 % fetalt bovint serum (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) och 1 % penicillin-streptomycin (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) vid 37 °C, 5 % CO2. Cellerna subkultiverades till 80 % konfluens med 0,05 % trypsin-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), centrifugerades vid 300 g och ströks ut med en densitet av cirka 7 × 10^ celler/ml. Alla experiment utfördes på odifferentierade SH-SY5Y-celler mellan passagerna 19–22. PPA administreras som NaP. Lös upp NaP-pulver (CAS-nr 137-40-6, kemisk formel C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) i varmt MilliQ-vatten till en koncentration av 1 M och förvara vid 4 °C. Späd ut lösningen med 1 M PPA till 3 mM och 5 mM PPA i serumfritt medium (DMEM/F-12 med L-glutamin) på behandlingsdagen. Behandlingskoncentrationerna för alla experiment var ingen PPA (0 mM, kontroll), 3 mM och 5 mM PPA. Experimenten utfördes i minst tre biologiska replikat.
SH-SY5Y-celler såddes i 25 cm³-kolvar med en hastighet av 5,5 × 10µ celler/ml och odlades i 24 timmar. PPA-behandlingen tillsattes till kolven före 24 timmars inkubation. Samla in cellpellets enligt normala protokoll för subkultur av däggdjursvävnad (beskrivet ovan). Resuspendera cellpelleten i 100 µl 2,5 % glutaraldehyd, 1× PBS och förvara vid 4 °C tills bearbetning. SH-SY5Y-celler centrifugerades kort för att pelletera cellerna och avlägsna 2,5 % glutaraldehyd, 1× PBS-lösning. Resuspendera sedimentet i en 4 % agarosgel framställd i destillerat vatten (förhållandet mellan agaros och sedimentvolym är 1:1). Agarosbitarna placerades på galler på plana plattor och belades med 1-hexadecen före högtrycksfrysning. Proverna frystes i 100 % torr aceton vid -90 °C i 24 timmar. Temperaturen höjdes sedan till -80 °C och en lösning av 1 % osmiumtetroxid och 0,1 % glutaraldehyd tillsattes. Proverna förvarades vid -80 °C i 24 timmar. Därefter ökades temperaturen gradvis till rumstemperatur under flera dagar: från –80 °C till –50 °C i 24 timmar, till –30 °C i 24 timmar, till –10 °C i 24 timmar och slutligen till rumstemperatur.
Efter kryogen beredning impregnerades proverna med harts och ultratunna snitt (∼100 nm) tillverkades med en Leica Reichert UltracutS ultramikrotom (Leica Microsystems). Snitt färgades med 2 % uranylacetat och blycitrat. Proverna observerades med ett FEI Tecnai 20 transmissionselektronmikroskop (ThermoFisher (tidigare FEI), Eindhoven, Nederländerna) som arbetade vid 200 kV (Lab6-sändare) och en Gatan CCD-kamera (Gatan, Storbritannien) utrustad med ett Tridiem-energifilter.
I varje tekniskt replikat togs minst 24 bilder av enskilda celler, totalt 266 bilder. Alla bilder analyserades med hjälp av makrot Region of Interest (ROI) och makrot Mitochondria. Det mitokondriella makrot är baserat på publicerade metoder17,31,32 och möjliggör halvautomatisk batchbehandling av TEM-bilder i Fiji/ImageJ69. I ett nötskal: bilden inverteras och inverteras med hjälp av bakgrundssubtraktion med rullande boll (60 pixlars radie) och ett FFT-bandpassfilter (med 60 respektive 8 pixlars övre och nedre gränser) och vertikal linjeundertryckning med en orienteringstolerans på 5 %. Den bearbetade bilden tröskelvärdesbestäms automatiskt med hjälp av en algoritm för maximal entropi och en binär mask genereras. Bildregioner associerade med manuellt valda ROI:er i råa TEM-bilder extraherades, vilket karakteriserade mitokondrier och exkluderade plasmamembranet och andra regioner med hög kontrast. För varje extraherad ROI analyserades binära partiklar större än 600 pixlar, och partikelarea, omkrets, huvud- och biaxlar, Feret-diameter, rundhet och cirkularitet mättes med hjälp av de inbyggda mätfunktionerna i Fiji/ImageJ. Enligt Merrill, Flippo och Strack (2017) beräknades area 2, partikelaspektförhållande (förhållande mellan huvud- och biaxel) och formfaktor (FF) från dessa data, där FF = omkrets 2/4pi x area. Definitionen av den parametriska formeln finns i Merrill, Flippo och Strack (2017). De nämnda makrona finns tillgängliga på GitHub (se Data Availability Statement). I genomsnitt analyserades cirka 5 600 partiklar per PPA-behandling, totalt cirka 17 000 partiklar (data visas ej).
SH-SH5Y-celler placerades i odlingsskålar med 8 kammare (ThermoFisher, #155411) för att tillåta vidhäftning över natten och inkuberades sedan med TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) och Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). Färgning. Bilder togs med 405 nm och 561 nm lasrar under en 10 minuters miljö, och råbilder togs som z-stacks innehållande 10 bildmikrografer med ett az-steg på 0,2 μm mellan bildrutorna vid 12 efterföljande tidpunkter. Bilder samlades in med en Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 superupplösningsplattform (Carl Zeiss, Oberkochen, Tyskland) med en LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27-lins. Bilder analyserades i ImageJ med hjälp av en tidigare beskriven pipeline och ImageJ-pluginet för att mäta fusions- och fissionshändelser, genomsnittligt antal mitokondriella strukturer och genomsnittlig mitokondrievolym per cell33. MEL-makron finns tillgängliga på GitHub (se Data Availability Statement).
SH-SY5Y-celler odlades i plattor med sex brunnar med en densitet av 0,3 × 106 celler/ml i 24 timmar före behandling. RNA extraherades med Quick-RNA™ Miniprep-protokollet (ZR R1055, Zymo Research) med smärre modifieringar: tillsätt 300 μl RNA-lysbuffert till varje brunn före uttagning och lysera varje prov som ett sista steg med 30 μl DNase/RNase-elueringsfritt vatten. Alla prover kontrollerades med avseende på kvantitet och kvalitet med en NanoDrop ND-1000 UV-Vis-spektrofotometer. Totalt protein från celllysat erhölls med 200 μl RIPA-lysbuffert och proteinkoncentrationen kvantifierades med Bradford-proteinanalysen70.
cDNA-syntes utfördes med hjälp av Tetro™ cDNA Synthesis Kit (BIO-65043, Meridian Bioscience) enligt tillverkarens instruktioner med vissa modifieringar. cDNA syntetiserades i 20 μl reaktioner med 0,7 till 1 μg totalt RNA. Primers valdes från tidigare publicerade artiklar 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (tabell S1) och medföljande prober designades med hjälp av PrimerQuest-verktyget från Integrated DNA Technologies. Alla gener av intresse normaliserades till den nukleära B2M-genen. Genuttrycket av STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC och OPA1 mättes med RT-qPCR. Mastermixen inkluderade LUNA Taq-polymeras (M3003L, New England Biolabs), 10 μM framåtriktade och bakåtriktade primers, cDNA och vatten av PCR-kvalitet för att ge en slutvolym på 10 μL för varje reaktion. Uttryck av delnings- och fissionsgener (DRP1, MFN1/2) mättes med hjälp av TaqMan-multiplexanalyser. Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) användes enligt tillverkarens instruktioner med mindre modifieringar. Multiplex RT-qPCR-mastermixen inkluderar 1X LUNA Taq-polymeras, 10 μM framåtriktade och bakåtriktade primers, 10 μM prob, cDNA och vatten av PCR-kvalitet, vilket resulterade i en slutvolym på 20 μL för varje reaktion. RT-qPCR utfördes med Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG—serienummer: R0618110). Cykelförhållandena visas i tabell S1. Alla cDNA-prover amplifierades i triplikat och en standardkurva genererades med en serie tiofaldiga utspädningar. Extremvärden i triplikatprover med cykeltröskelstandardavvikelse (Ct) > 0,5 togs bort från analysen för att säkerställa datas reproducerbarhet30,72. Relativt genuttryck beräknades med 2-ΔΔCt79-metoden.
Proteinprover (60 μg) blandades med Laemmli-laddningsbuffert i förhållandet 2:1 och kördes på en 12 % färglös proteingel (Bio-Rad #1610184). Proteinerna överfördes till ett PVDF (polyvinylidenfluorid)-membran (#170-84156, Bio-Rad) med hjälp av Trans-Blot Turbo-systemet (#170-4155, Bio-Rad). Membranet blockerades och inkuberades med lämpliga primära antikroppar (OPA1, MFN1, MFN2 och DRP1) (utspädda 1:1000) i 48 timmar, följt av inkubation med sekundära antikroppar (1:10 000) i 1 timme. Membranen avbildades sedan med Clarity Western ECL Substrate (#170-5061, Bio-Rad) och registrerades med ett Bio-Rad ChemiDoc MP-system. ImageLab version 6.1 användes för Western blot-analys. Den ursprungliga gelen och blotten visas i figur S1. Information om antikroppar finns i tabell S2.
Dataset presenteras som medelvärde och standardfel för medelvärdet (SEM) för minst tre oberoende stickprov. Dataseten testades för normalitet med Shapiro-Wilks-testet (om inget annat anges) innan en Gaussisk fördelning och lika standardavvikelser antogs och analyserna fortsatte. Utöver analys av datasetet användes Fishers MEL LSD (p < 0,05), envägs ANOVA (behandling vs. kontrollmedelvärde) och Dunnetts multipla jämförelsetest för att bestämma signifikans (p < 0,05). Signifikanta p-värden visas i grafen som *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Alla statistiska analyser och grafer utfördes och genererades med GraphPad Prism 9.4.0.
Fiji/ImageJ-makron för TEM-bildanalys är offentligt tillgängliga på GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Makrot Mitochondrial Event Locator (MEL) är offentligt tillgängligt på GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM och Vijaya A. Mitokondrier: huvudregulatorer av metabolism, homeostas, stress, åldrande och epigenetik. Indonesian. Biomedical Science. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Mångfacetterad mitokondriell dysfunktion vid schizofreni, komplex I som ett möjligt patologiskt mål. Schizophrenia. resource. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. och Beal, MF Mitokondriell dysfunktion vid Parkinsons sjukdom. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG och Mehta V. Stressade mitokondrier: mål för invasion vid Alzheimers sjukdom. Mitochondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF och Ferreira GK Mitokondrier och hjärnan: bioenergetik och mer. Neurotoxiner. resurs. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. et al. Pleiotropa mitokondrier: mitokondriernas inverkan på neuronal utveckling och sjukdom. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. och Morais, VA Mitokondriell biogenes i neuroner: hur och var. internationalitet. J. Mohr. vetenskapen. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. och Zhao, J. Reglering av mitokondriedynamik hos däggdjur: möjligheter och utmaningar. front. endokrin. (Lausanne) 11, 374 (2020).
Khacho, M. och Slack, RS Mitokondriell dynamik i regleringen av neurogenes: från den utvecklande till vuxna hjärnan. utveckling. dynamik. 247, 47–53 (2018).