Nuvarande *Nuvarande adress: Köln 50931, Tyskland, Cologne Excellence Cluster Research on Cellular Stress Response in Aging-related Diseases (CECAD).
Neurodegenerationen av mitokondriella sjukdomar anses vara irreversibel eftersom neuronernas metaboliska plasticitet är begränsad, men effekten av mitokondriell dysfunktion på cellens autonomi i neuronal metabolism i kroppen är dåligt förstådd. Här introducerar vi det cellspecifika proteomet hos Purkinje-neuroner med progressiv OXPHOS-brist orsakad av störd mitokondriell fusionsdynamik. Vi fann att mitokondriell dysfunktion utlöste en djupgående förändring inom proteomik, vilket i slutändan ledde till sekventiell aktivering av exakta metaboliska program före celldöd. Oväntat konstaterade vi den uppenbara induktionen av pyruvatkarboxylas (PCx) och andra anti-aging-enzymer som kompletterar intermediärerna i TCA-cykeln. Hämning av PCx förvärrade oxidativ stress och neurodegeneration, vilket indikerar att ateroskleros har en skyddande effekt i neuroner som saknar OXPHOS. Återställandet av mitokondriell fusion i terminalt degenererade neuroner reverserar fullständigt dessa metaboliska egenskaper och förhindrar därmed celldöd. Våra resultat identifierar tidigare okända vägar som ger motståndskraft mot mitokondriell dysfunktion och visar att neurodegeneration kan reverseras även i de sena stadierna av sjukdomen.
Mitokondriernas centrala roll i att upprätthålla neuronal energimetabolism betonas av de omfattande neurologiska symtom som är förknippade med mänskliga mitokondriella sjukdomar. De flesta av dessa sjukdomar orsakas av genmutationer som reglerar mitokondriellt genuttryck (1, 2) eller genförstörelse relaterad till mitokondriedynamik, vilket indirekt påverkar stabiliteten hos mitokondriellt DNA (mtDNA) (3, 4). Arbete i djurmodeller har visat att som svar på mitokondriell dysfunktion i omgivande vävnader kan konservativa metaboliska vägar (5-7) aktiveras, vilket ger viktig information för en djupgående förståelse av patogenesen för dessa komplexa sjukdomar. I skarp kontrast är vår förståelse av de metaboliska förändringarna hos specifika celltyper som orsakas av det allmänna misslyckandet med hjärnans mitokondriella adenosintrifosfat (ATP)-produktion grundläggande (8), vilket betonar behovet av att identifiera terapeutiska mål som kan användas för att förebygga eller förhindra sjukdom (9). Bristen på information beror på att nervceller allmänt anses ha mycket begränsad metabolisk flexibilitet jämfört med celltyperna i omgivande vävnader (10). Med tanke på att dessa celler spelar en central roll i att koordinera tillförseln av metaboliter till neuroner för att främja synaptisk transmission och reagera på skador och sjukdomstillstånd, är förmågan att anpassa cellmetabolismen till de utmanande förhållandena i hjärnvävnaden nästan begränsad till gliaceller (11-14). Dessutom hindrar den inneboende cellulära heterogeniteten i hjärnvävnaden i hög grad studier av metaboliska förändringar som sker i specifika neuronala undergrupper. Som ett resultat är lite känt om de exakta cellulära och metaboliska konsekvenserna av mitokondriell dysfunktion i neuroner.
För att förstå de metaboliska konsekvenserna av mitokondriell dysfunktion isolerade vi Purkinje-neuroner (PN) i olika stadier av neurodegeneration orsakad av förstörelse av mitokondriefusion i det yttre membranet (Mfn2). Även om Mfn2-mutationer hos människor är associerade med en form av ärftlig motorisk sensorisk neuropati känd som Charcot-Marie-Tooth typ 2A (15), är den villkorliga förstörelsen av Mfn2 hos möss en välkänd metod för induktion av oxidationsfosforylering (OXPHOS). De olika neuronala subtyperna (16-19) och den resulterande neurodegenerativa fenotypen åtföljs av progressiva neurologiska symtom, såsom rörelsestörningar (18, 19) eller cerebellär ataxi (16). Genom att använda en kombination av märkningsfri kvantitativ (LFQ) proteomik, metabolomik, avbildning och virologiska metoder visar vi att progressiv neurodegeneration starkt inducerar pyruvatkarboxylas (PCx) och andra faktorer involverade i åderförkalkning av PN in vivo, uttryck av enzymer. För att verifiera relevansen av detta fynd nedreglerade vi specifikt uttrycket av PCx i Mfn2-bristfälliga PN:er och fann att denna operation förvärrade oxidativ stress och accelererade neurodegeneration, vilket bevisar att azoospermi ger celldöd metabolisk anpassningsförmåga. Kraftigt uttryck av MFN2 kan helt återställa den terminala degenerativa PN med svår OXPHOS-brist, massiv konsumtion av mitokondriellt DNA och till synes trasigt mitokondriellt nätverk, vilket ytterligare betonar att denna form av neurodegeneration även kan återhämta sig i ett avancerat stadium av sjukdomen före celldöd.
För att visualisera mitokondrierna i Mfn2-knockout-PN:er använde vi en musstam som tillåter Cre-beroende mitokondrier att rikta in sig på Cre-uttryck i gult fluorescerande protein (YFP) (mtYFP) (20) och kontrollerade den mitokondriella morfologin in vivo. Vi fann att förstörelsen av Mfn2-genen i PN:er skulle leda till en gradvis delning av det mitokondriella nätverket (Figur S1A), och den tidigaste förändringen observerades vid 3 veckors ålder. Däremot började den betydande degenerationen av PN-cellskiktet, vilket framgår av förlusten av Calbindin-immunfärgning, inte förrän vid 12 veckors ålder (Figur 1, A och B). Tidsskillnaden mellan de tidigaste förändringarna i mitokondriell morfologi och den synliga starten av neuronal död fick oss att undersöka de metaboliska förändringar som utlöses av mitokondriell dysfunktion före celldöd. Vi utvecklade en fluorescensaktiverad cellsorteringsbaserad (FACS) strategi för att isolera YFP (YFP+)-uttryckande PN (Figur 1C), och i kontrollmöss (Mfn2+ / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), nedan kallad CTRL (Figur S1B). Optimeringen av gatingstrategin baserad på den relativa intensiteten hos YFP-signalen gör det möjligt för oss att rena YFP+ kroppen (YFPhigh) från PN från icke-PN (YFPneg) (Figur S1B) eller förmodade fluorescerande axon/dendritiska fragment (YFPlow; Figur S1D, vänster), bekräftat med konfokalmikroskop (Figur S1D, höger). För att verifiera identiteten hos den klassificerade populationen utförde vi LFQ-proteomik och sedan principal component analysis, och fann att det finns en tydlig separation mellan YFPhigh- och YFPneg-celler (Figur S1C). YFPhigh-celler uppvisade en nettoanrikning av kända PN-markörer (dvs. Calb1, Pcp2, Grid2 och Itpr3) (21, 22), men ingen anrikning av proteiner som vanligtvis uttrycks i neuroner eller andra celltyper (Figur 1D)). En jämförelse mellan prover i klassificerade YFPhigh-celler som samlats in i oberoende experiment visade en korrelationskoefficient > 0,9, vilket visar god reproducerbarhet mellan biologiska replikat (Figur S1E). Sammanfattningsvis validerade dessa data vår plan för akut och specifik isolering av möjlig PN. Eftersom det använda L7-cre-drivsystemet inducerar mosaikrekombination under den första veckan efter förlossningen (23), började vi gallra möss från CTRL och villkorlig (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) insamling av neuroner. Efter att rekombinationen är klar kallas den för Mfn2cKO vid 4 veckors ålder. Som slutpunkt valde vi 8 veckors ålder när PN-lagret var intakt trots den uppenbara mitokondriella fragmenteringen (Figur 1B och Figur S1A). Totalt kvantifierade vi totalt 3013 proteiner, varav cirka 22 % baserades på MitoCarta 2.0-annoteringar baserade på det mitokondriella proteomet som mitokondrier (Figur 1E) (Figur 1E) (24). Den differentiella genuttrycksanalysen som utfördes vid vecka 8 visade att endast 10,5 % av alla proteiner hade signifikanta förändringar (Figur 1F och Figur S1F), varav 195 proteiner var nedreglerade och 120 proteiner var uppreglerade (Figur 1F). Det är värt att notera att den "innovativa väganalysen" av denna datamängd visar att de differentiellt uttryckta generna huvudsakligen tillhör en begränsad uppsättning specifika metaboliska vägar (Figur 1G). Intressant nog, även om nedregleringen av signalvägar relaterade till OXPHOS och kalciumsignalering bekräftar induktionen av mitokondriell dysfunktion i fusionsbristfälliga PN, är andra kategorier som huvudsakligen involverar aminosyrametabolism signifikant uppreglerade, vilket är i linje med den metabolism som sker i mitokondriella PN:er. Omkoppling är konsekvent.
(A) Representativa konfokala fotografier av cerebellära sektioner av CTRL- och Mfn2cKO-möss som visar progressiv förlust av PN (calbindin, grå); kärnor motfärgades med DAPI. (B) Kvantifiering av (A) (envägsvariansanalys, ***P <0,001; n = 4 till 6 cirklar från tre möss). (C) Experimentellt arbetsflöde. (D) Värmekartafördelning av markörer specifika för Purkinje (överst) och andra celltyper (mitten). (E) Venn-diagram som visar antalet mitokondriella proteiner identifierade i det klassificerade PN. (F) Vulkandiagram över differentiellt uttryckta proteiner i Mfn2cKO-neuroner vid 8 veckor (signifikansgränsvärde på 1,3). (G) Analysen av kreativitetsvägarna visar de fem viktigaste uppreglerings- (röda) och nedreglerings- (blå) vägarna i Mfn2cKO PN klassificerat som 8 veckor. Den genomsnittliga uttrycksnivån för varje detekterat protein visas. Gråskalevärmekarta: justerat P-värde. ns, inte viktigt.
Proteomikdata visade att proteinuttrycket av komplex I, III och IV gradvis minskade. Komplex I, III och IV innehöll alla essentiella mtDNA-kodade subenheter, medan komplex II, som endast var kärnkodat, i princip var opåverkat (Figur 2A och Figur S2A). I ​​överensstämmelse med proteomikresultaten visade immunhistokemi av cerebellära vävnadssnitt att MTCO1-subenhetsnivån (mitokondrie cytokrom C-oxidas-subenhet 1) av komplex IV i PN gradvis minskade (Figur 2B). Den mtDNA-kodade subenheten Mtatp8 minskade signifikant (Figur S2A), medan steady-state-nivån av den kärnkodade ATP-syntas-subenheten förblev oförändrad, vilket överensstämmer med det kända stabila ATP-syntas-subaggregatet F1-komplexet när mtDNA-uttrycket är stabilt. Bildningen är konsekvent. Avbrott (7). Utvärdering av mtDNA-nivån i de sorterade Mfn2cKO-PN:erna med realtidspolymeraskedjereaktion (qPCR) bekräftade den gradvisa minskningen av antalet mtDNA-kopier. Jämfört med kontrollgruppen, vid 8 veckors ålder, behölls endast cirka 20 % av mtDNA-nivån (Figur 2C). I överensstämmelse med dessa resultat användes konfokalmikroskopifärgning av Mfn2cKO-PN:er för att detektera DNA, vilket visar den tidsberoende konsumtionen av mitokondriella nukleotider (Figur 2D). Vi fann att endast vissa kandidater involverade i mitokondriell proteinnedbrytning och stressrespons var uppreglerade, inklusive Lonp1, Afg3l2 och Clpx, samt OXPHOS-komplexsammansättningsfaktorer. Inga signifikanta förändringar i nivåerna av proteiner involverade i apoptos detekterades (Figur S2B). På liknande sätt fann vi att mitokondrierna och endoplasmatiska retikulumkanalerna involverade i kalciumtransport endast har mindre förändringar (Figur S2C). Dessutom fann utvärderingen av autofagirelaterade proteiner inga signifikanta förändringar, vilket överensstämmer med den synliga induktionen av autofagosomer observerad in vivo genom immunohistokemi och elektronmikroskopi (Figur S3). Den progressiva OXPHOS-dysfunktionen i PNs åtföljs dock av uppenbara ultrastrukturella mitokondriella förändringar. Mitokondriella kluster kan ses i cellkropparna och dendritiska träden hos Mfn2cKO PNs vid 5 och 8 veckors ålder, och den inre membranstrukturen har genomgått djupgående förändringar (Figur S4, A och B). I överensstämmelse med dessa ultrastrukturella förändringar och en signifikant minskning av mtDNA, visade analys av akuta cerebrala cerebellära skivor med tetrametylrhodaminmetylester (TMRM) att den mitokondriella membranpotentialen i Mfn2cKO PNs minskade signifikant (Figur S4C).
(A) Tidsförloppsanalys av uttrycksnivån av OXPHOS-komplexet. Betrakta endast proteiner med P < 0,05 vid 8 veckor (tvåvägs ANOVA). Streckad linje: Ingen justering jämfört med CTRL. (B) Vänster: Ett exempel på en cerebellär sektion märkt med anti-MTCO1-antikropp (skalstapel, 20 μm). Området som upptas av Purkinje-cellkroppar är täckt av gult. Höger: Kvantifiering av MTCO1-nivåer (envägsvariansanalys; n = 7 till 20 celler analyserade från tre möss). (C) qPCR-analys av mtDNA-kopieantal i den sorterade PN (envägsvariansanalys; n = 3 till 7 möss). (D) Vänster: Ett exempel på en cerebellär skiva märkt med en anti-DNA-antikropp (skalstapel, 20 μm). Området som upptas av Purkinje-cellkroppar är täckt av gult. Höger: Kvantifiering av mtDNA-lesioner (envägsvariansanalys; n = 5 till 9 celler från tre möss). (E) Ett exempel på en akut cerebellär sektion som visar mitoYFP + Purkinjeceller (pil) i en helcells patch clamp-inspelning. (F) Kvantifiering av IV-kurva. (G) Representativa inspelningar av depolariserande ströminjektion i CTRL- och Mfn2cKO Purkinjeceller. Övre spår: Den första pulsen som utlöste AP. Nedersta spår: Maximal AP-frekvens. (H) Kvantifiering av postsynaptiska spontana insignaler (sPSP). Det representativa inspelningsspåret och dess zoomförhållande visas i (I). Envägsvariansanalys analyserades med n = 5 till 20 celler från tre möss. Data uttrycks som medelvärde ± SEM; *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001. (J) Representativa spår av spontan AP inspelad med perforerad patch clamp-läge. Övre spår: Maximal AP-frekvens. Nedersta spår: zoom av en enda AP. (K) Kvantifiera den genomsnittliga och maximala AP-frekvensen enligt (J). Mann-Whitney-test; n = 5 celler analyserades från fyra möss. Data uttrycks som medelvärde ± SEM; inte viktigt.
Tydlig OXPHOS-skada upptäcktes i den 8 veckor gamla Mfn2cKO PN, vilket indikerar att neuronernas fysiologiska funktion är allvarligt onormal. Därför analyserade vi de passiva elektriska egenskaperna hos OXPHOS-bristfälliga neuroner vid 4 till 5 veckor och 7 till 8 veckor genom att utföra helcells patch clamp-inspelningar i akuta cerebellära skivor (Figur 2E). Oväntat nog var den genomsnittliga vilomembranpotentialen och ingångsresistansen hos Mfn2cKO-neuroner liknande kontrollen, även om det fanns subtila skillnader mellan cellerna (Tabell 1). På liknande sätt hittades inga signifikanta förändringar i ström-spänningsförhållandet (IV-kurva) vid 4 till 5 veckors ålder (Figur 2F). Emellertid överlevde inga Mfn2cKO-neuroner 7 till 8 veckor gamla IV-regimen (hyperpolarisationssteg), vilket indikerar att det finns en tydlig känslighet för hyperpolarisationspotential i detta sena skede. Däremot tolereras de depolariserande strömmarna som orsakar repetitiva urladdningar av aktionspotential (AP) väl i Mfn2cKO-neuroner, vilket indikerar att deras övergripande urladdningsmönster inte skiljer sig signifikant från de hos 8 veckor gamla kontrollneuroner (tabell 1 och figur 2G). På liknande sätt var frekvensen och amplituden för spontana postsynaptiska strömmar (sPSC) jämförbara med kontrollgruppens, och händelsefrekvensen ökade från 4 veckor till 5 veckor till 7 veckor till 8 veckor med en liknande ökning (figur 2, H och I). Perioden för synaptisk mognad i PN (25). Liknande resultat erhölls efter perforerade PN-patchar. Denna konfiguration förhindrar möjlig kompensation av cellulära ATP-defekter, vilket kan hända vid patchclamp-inspelning av hela celler. I synnerhet påverkades inte vilomembranpotentialen och spontan avfyrningsfrekvens hos Mfn2cKO-neuroner (figur 2, J och K). Sammanfattningsvis indikerar dessa resultat att PN:er med uppenbar OXPHOS-dysfunktion kan hantera högfrekventa urladdningsmönster väl, vilket indikerar att det finns en kompensationsmekanism som gör att de kan upprätthålla nästan normala elektrofysiologiska svar.
Data uttrycks som medelvärde ± SEM (envägsvariansanalys, Holm-Sidaks multipla jämförelsetest; *P<0,05). Enhetsnumret anges med parenteser.
Vi undersökte om någon kategori i proteomikdatasetet (Figur 1G) innehåller signalvägar som kan motverka allvarlig OXPHOS-brist, och därigenom förklara varför drabbade PN kan upprätthålla nästan normal elektrofysiologi (Figur 2, E till K). Proteomikanalys visade att de enzymer som är involverade i katabolismen av grenade aminosyror (BCAA) var signifikant uppreglerade (Figur 3A och Figur S5A), och slutprodukten acetyl-CoA (CoA) eller succinyl CoA kan komplettera trikarboxylaterna i åderförkalkningssyracykeln (TCA). Vi fann att innehållet av BCAA-transaminas 1 (BCAT1) och BCAT2 båda ökade. De katalyserar det första steget i BCAA-katabolismen genom att generera glutamat från α-ketoglutarat (26). Alla subenheter som utgör det grenade kedjeketosyradehydrogenaskomplexet (BCKD) är uppreglerade (komplexet katalyserar den efterföljande och irreversibla dekarboxyleringen av det resulterande BCAA-kolskelettet) (Figur 3A och Figur S5A). Emellertid hittades inga uppenbara förändringar i själva BCAA i det sorterade PN, vilket kan bero på det ökade cellulära upptaget av dessa essentiella aminosyror eller användningen av andra källor (glukos eller mjölksyra) för att komplettera TCA-cykeln (Figur S5B). PN som saknar OXPHOS uppvisade också ökad glutaminnedbrytning och transamineringsaktivitet vid 8 veckors ålder, vilket kan återspeglas i uppregleringen av de mitokondriella enzymerna glutaminas (GLS) och glutaminpyruvattransaminas 2 (GPT2) (Figur 3, A och C). Det är värt att notera att uppregleringen av GLS är begränsad till den splitsade isoformen glutaminas C (GLS-GAC) (förändringen av Mfn2cKO/CTRL är ungefär 4,5-faldig, P = 0,05), och dess specifika uppreglering i cancervävnader kan stödja mitokondriell bioenergi. (27).
(A) Värmekartan visar förändringen i proteinnivå för den specificerade vägen vid 8 veckor. (B) Exempel på en cerebellär skiva märkt med anti-PCx-antikropp (skalstapel, 20 μm). Den gula pilen pekar på Purkinjecellkroppen. (C) Tidsförloppsanalys av proteinuttryck identifierad som en viktig kandidat för ateroskleros (multipel t-test, *FDR <5%; n = 3-5 möss). (D) Ovan: Ett schematiskt diagram som visar de olika sätten att komma in i det märkta kolet som finns i [1-13C]pyruvat-spårämnet (dvs. via PDH eller transarteriell väg). Nederst: Fioldiagrammet visar procentandelen enkelmärkt kol (M1) omvandlad till asparaginsyra, citronsyra och äppelsyra efter märkning av akuta cerebellära skivor med [1-13C]pyruvat (parat t-test; ** P <0,01). (E) Omfattande tidshistorikanalys av den angivna vägen. Betrakta endast proteiner med P <0,05 vid 8 veckor. Streckad linje: inget justeringsvärde (tvåvägs variansanalys; * P <0,05; *** P <0,001). Data uttrycks som medelvärde ± SEM.
I vår analys har BCAA-katabolism blivit en av de viktigaste uppregleringsvägarna. Detta faktum tyder starkt på att ventilationsvolymen som går in i TCA-cykeln kan förändras i PN som saknar OXPHOS. Detta kan representera en viktig form av neuronal metabolisk omkoppling, vilket kan ha en direkt inverkan på neuronal fysiologi och överlevnad under upprätthållandet av allvarlig OXPHOS-dysfunktion. I överensstämmelse med denna hypotes fann vi att det huvudsakliga anti-aterosklerotiska enzymet PCx är uppreglerat (Mfn2cKO/CTRL förändras ungefär 1,5 gånger; figur 3A), vilket katalyserar omvandlingen av pyruvat till oxaloacetat (28), vilket tros finnas i hjärnvävnad. Uttrycket i är begränsat till astrocyter (29, 30). I överensstämmelse med proteomikresultaten visade konfokalmikroskopi att PCx-uttrycket specifikt och signifikant ökade i OXPHOS-bristfälliga PN, medan PCx-reaktiviteten huvudsakligen var begränsad till de intilliggande Bergmann-gliacellerna i kontrollen (figur 3B). För att funktionellt testa den observerade uppregleringen av PCx behandlade vi akuta cerebellära skivor med [1-13C]pyruvat-spårämne. När pyruvat oxiderades av pyruvatdehydrogenas (PDH) försvann dess isotopmärkning, men den inkorporeras i TCA-cykelns intermediärer när pyruvat metaboliseras genom vaskulära reaktioner (Figur 3D). Till stöd för våra proteomikdata observerade vi ett stort antal markörer från detta spårämne i asparaginsyran i Mfn2cKO-skivor, medan citronsyra och äppelsyra också hade en måttlig trend, men inte signifikant (Figur 3D).
I dopaminneuronerna hos MitoPark-möss med mitokondriell dysfunktion orsakad av dopaminneuroner som specifikt förstör den mitokondriella transkriptionsfaktor A-genen (Tfam) (Figur S6B), var PCx-uttrycket också signifikant uppreglerat (31), vilket indikerar att acetonsyraarterioskleros. Förekomsten av sjukdomen regleras under dysfunktionen hos neuronal OXPHOS i kroppen. Det är värt att notera att det har visat sig att unika enzymer (32-34) som kan uttryckas i neuroner som kan vara associerade med åderförkalkning är signifikant uppreglerade i PN som saknar OXPHOS, såsom propionyl-CoA-karboxylas (PCC-A), malonyl-CoA omvandlar propionyl-CoA till succinyl-CoA och mitokondriellt äppelenzym 3 (ME3), vars huvudsakliga roll är att återvinna pyruvat från malat (Figur 3, A och C) (33, 35). Dessutom fann vi en signifikant ökning av Pdk3-enzymet, som fosforylerar och därmed inaktiverar PDH (36), medan inga förändringar detekterades i Pdp1-enzymet som aktiverar PDH eller själva PDH-enzymkomplexet (Figur 3A). Genomgående ökade fosforyleringen av α1-subenheten α (PDHE1α) i pyruvatdehydrogenas E1-komponenten i PDH-komplexet i Ser293 (känt för att hämma enzymaktiviteten hos PDH) i Mern2cKO PNs (Figur S6C) (Figur S6C). Pyruvat har ingen vaskulär åtkomst.
Slutligen fann vi att supervägen för serin- och glycinbiosyntes, den relaterade mitokondriella folatcykeln (1C) och prolinbiosyntesen (Figur 1G och Figur S5C) alla är signifikant uppreglerade, enligt rapporter, under aktiveringsprocessen. De omgivande vävnaderna aktiveras med mitokondriell dysfunktion (5-7). Konfokal analys som stöder dessa proteomikdata visade att i PN utan OXPHOS utsattes cerebellära skivor av 8 veckor gamla möss för serinhydroximetyltransferas 2 (SHMT2), ett viktigt enzym i den mitokondriella folatcykeln. Signifikant immunsvar (Figur S5D). I 13 CU-glukosinkuberade akuta cerebellära skivor bekräftade metaboliska spårningsexperiment ytterligare uppregleringen av serin- och prolinbiosyntes, vilket indikerar att flödet av kolisoformer till serin och prolin ökade (Figur S5E). Eftersom reaktionerna som främjas av GLS och GPT2 är ansvariga för syntesen av glutamat från glutamin och transamineringen mellan glutamat och α-ketoglutarat, indikerar deras uppreglering att OXPHOS-bristfälliga neuroner har ett ökat behov av glutamat. Detta kan syfta till att upprätthålla den ökade biosyntesen av prolin (Figur S5C). I motsats till dessa förändringar visade en proteomanalys av cerebellära astrocyter från PN-specifika Mfn2cKO-möss att dessa vägar (inklusive alla antiperoxidaser) inte förändrades signifikant i uttryck, vilket visar att denna metaboliska omdirigering är selektiv mot nedbruten PN (Fig. S6, D till G).
Sammanfattningsvis avslöjade dessa analyser signifikant olika mönster för tidsmässig aktivering av specifika metaboliska vägar i PN:er. Även om onormal neuronal mitokondriell funktion kan leda till tidig ateroskleros och 1C-ombyggnad (Figur 3E och Figur S5C), och till och med förutsägbara förändringar i uttrycket av I- och IV-komplex, är förändringarna i serin de novo-syntesen först uppenbara i sena stadier. OXPHOS-dysfunktion (Figur 3E och Figur S5C). Dessa fynd definierar en sekventiell process där den stressinducerade mitokondriella (1C-cykeln) och cytoplasmatiska (serinbiosyntesen) svarar synergistiskt med ökningen av ateroskleros i TCA-cykeln för att omforma neuronal metabolism.
8 veckor gamla OXPHOS-bristfälliga PN:er kan bibehålla högfrekvent excitationsaktivitet och genomgå betydande metabolisk återanslutning för att kompensera för mitokondriell dysfunktion. Denna upptäckt ger upphov till en intressant möjlighet att även i detta ögonblick kan dessa celler också få terapeutisk intervention för att fördröja eller förhindra neurodegeneration. Vi löste denna möjlighet genom två oberoende interventioner. I den första metoden designade vi en Cre-beroende adenoassocierad virusvektor (AAV) så att MFN2 kan uttryckas selektivt i OXPHOS-bristfälliga PN:er in vivo (Figur S7A). AAV:n som kodar för MFN2 och den fluorescerande reportergenen mCherry (Mfn2-AAV) verifierades i primära neuronkulturer in vitro, vilket orsakade att MFN2 uttrycktes på ett Cre-beroende sätt och räddade den mitokondriella morfologin, vilket förhindrade neuromutation i Mfn2cKO-neuroner (Figur S7, B, D och E). Därefter utförde vi in ​​vivo-experiment för att stereotaktiskt leverera 8 veckor gammal Mfn2-AAV till cerebellärbarken hos Mfn2cKO- och kontrollmöss, och analyserade 12 veckor gamla möss (Figur 4A). De behandlade Mfn2cKO-mössen dog (Figur 1, A och B) (16). Viral transduktion in vivo resulterade i selektivt uttryck av PN i vissa cerebellära cirklar (Figur S7, G och H). Injektionen av kontroll-AAV som endast uttrycker mCherry (Ctrl-AAV) hade ingen signifikant effekt på graden av neurodegeneration hos Mfn2cKO-djur. Däremot visade analysen av Mfn2cKO:er transducerade med Mfn2-AAV en signifikant skyddande effekt av PN-cellskiktet (Figur 4, B och C). I synnerhet verkar neurontätheten vara nästan oskiljbar från kontrolldjurens (Figur 4, B och C, och Figur S7, H och I). Uttrycket av MFN1, men inte MFN2, är lika effektivt för att rädda neuronal död (Figur 4C och Figur S7, C och F), vilket indikerar att uttrycket av ektopisk MFN1 effektivt kan komplettera bristen på MFN2. Ytterligare analys på den enskilda PN-nivån visade att Mfn2-AAV till stor del räddade mitokondriernas ultrastruktur, normaliserade mtDNA-nivåerna och reverserade det höga uttrycket av anti-angiogenesmarkören PCx (Figur 4, C till E). Visuell inspektion av de räddade Mfn2cKO-mössen i vilotillstånd visade att deras hållning och motoriska symtom (rörelse S1 till S3) förbättrades. Sammanfattningsvis visar dessa experiment att fördröjd återintroduktion av MFN2 i PN:er med allvarlig brist på OXPHOS är tillräckligt för att reversera mtDNA-konsumtion och inducera ateroskleros, och därigenom förhindra axondegeneration och neuronal död in vivo.
(A) Ett schema som visar det experimentella schemat för injektion av AAV som kodar för MFN2 när den angivna metaboliska vägen aktiveras. (B) Representativa konfokala bilder av 12 veckor gamla cerebellära skivor transducerade vid 8 veckor i Mfn2cKO-möss och märkta med anti-Calbindin-antikropp. Höger: Skalning av axonfibrer. Skalan för axonzoomningen är 450 och 75 μm. (C) Vänster: Kvantifiering av Purkinjecelldensitet i AAV-transduktionsslingan (AAV+) (envägsvariansanalys; n = 3 möss). Höger: mtDNA-fokusanalys i transducerad PN vid vecka 12 (oparat t-test; n = 6 celler från tre möss). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Representativa transmissionselektronmikroskopbilder av PN:er från Mfn2cKO-cerebellära sektioner transducerade med de angivna virala vektorerna. Den rosa masken illustrerar det område som upptas av dendriter, och den gulprickade rutan illustrerar zoomen till höger; n representerar kärnan. Skalstreck, 1 μm. (E) visar ett exempel på PCx-färgning i PN transducerad vid 12 veckor. Skalstreck, 20 μm. OE, överuttryck; FC, fold change.
Slutligen undersökte vi vikten av peroxidasinducerad cellöverlevnad hos PN:er som har upplevt OXPHOS-dysfunktion. Vi genererade mCherry som kodar för AAV-shRNA (short hairpin RNA) specifikt riktat mot mus-PCx mRNA (AAV-shPCx), och injicerade viruset eller dess krypterade kontroll (AAV-scr) i lillhjärnan hos Mfn2cKO-möss. Injektionen utfördes under den fjärde veckans ålder (Figur 5A) för att uppnå effektiv PCx-nedbrytning under den period då PCx-uttrycket ökade (Figur 3C) och PN-cellskiktet fortfarande var intakt (Figur 1A). Det är värt att notera att nedbrytning av PCx (Figur S8A) leder till en signifikant acceleration av PN-död, vilket är begränsat till den infekterade ringen (Figur 5, B och C). För att förstå mekanismen bakom de metaboliska effekter som induceras av PCx-uppreglering studerade vi redoxstatusen hos PN efter att PCx-knockdown och AAV-medierad optisk biosensor Grx1-roGFP2 uttryckts samtidigt (Figur S8, B till D) för att utvärdera glutation. Den relativa förändringen av peptidredoxpotential (38). Därefter utförde vi tvåfotonfluorescenslivstidsavbildningsmikroskopi (FLIM) i akuta hjärnskivor från 7 veckor gamla Mfn2cKO- eller kontrollkullsyskon för att detektera potentiella förändringar i cytoplasmisk redoxstatus efter att ha verifierat FLIM-förhållanden (Figur S8, E till G). Analysen visade en signifikant ökning av oxidationstillståndet hos en enskild Mfn2cKO-PN som saknar PCx-uttryck, vilket skiljer sig från kontrollneuroner eller Mfn2cKO-PN som endast uttrycker krypterat shRNA (Figur 5, D och E). När PCx-uttrycket nedreglerades ökade andelen Mfn2cKO-PN som uppvisade ett starkt oxiderat tillstånd med mer än tre gånger (Figur 5E), vilket indikerar att PCx-uppreglering bibehöll redoxkapaciteten hos degenererade neuroner.
(A) Ett schema som visar det experimentella schemat för injektion av AAV som kodar för shPCx när den angivna metaboliska vägen aktiveras. (B) Representativa konfokala fotografier av 8 veckor gamla cerebellära sektioner i Mfn2cKO-möss transducerade och märkta med anti-calcineurin-antikroppar vid 4 veckor. Skalstreck, 450 μm. (C) Kvantifiering av Purkinjecelldensitet i AAV-transducerade loopar (envägsvariansanalys; n = 3 till 4 möss). Data uttrycks som medelvärde ± SEM; ***P < 0,001. (D) Representativ FLIM-bild visar den genomsnittliga livslängden för 7 veckor gamla PN-uttryckande glutationredoxsensor Grx1-roGFP2 under de specificerade experimentella förhållandena. LUT-förhållande (look-up table): överlevnadstidsintervall (i pikosekunder). Skalstreck, 25 μm. (E) Histogrammet visar fördelningen av Grx1-roGFP2 livstidsvärden från (D) (n=158 till 368 celler i två möss under varje tillstånd). Cirkeldiagrammet ovanför varje histogram visar antalet celler med signifikant längre (röda, oxiderade) eller kortare (blå, reducerade) livslängdsvärden, vilka överstiger 1 SD av det genomsnittliga livslängdsvärdet i CTRL-AAV-scr. (F) Den föreslagna modellen visar den skyddande effekten av uppreglering av neuronal PCx.
Sammantaget visar de data vi tillhandahåller här att återuttryck av MFN2 helt kan rädda avancerad PN med allvarlig OXPHOS-brist, allvarlig mtDNA-utarmning och extremt onormal ista-liknande morfologi, vilket ger kontinuerliga framsteg även vid avancerade sjukdomar. Neurodegeneration ger reversibla bevis på stadiet före celldöd. Denna grad av metabolisk flexibilitet betonas ytterligare av neuronernas förmåga att inducera ateroskleros (en omkoppling av TCA-cykeln), vilket hämmar PCx-uttryck i PN som saknar OXPHOS och förstärker celldöd, och därigenom spelar en skyddande roll (Figur 5F).
I denna studie presenterade vi bevis för att PNs svar på OXPHOS-dysfunktion är att gradvis konvergera till TCA-cykelateroskleros genom den differentiella aktiveringsvägen som aktiveras av metaboliska program. Vi bekräftade den proteomiska analysen med många kompletterande metoder och avslöjade att neuroner, när de utmanas av allvarlig mitokondriell dysfunktion, har en tidigare okänd form av metabolisk elasticitet. Till vår förvåning markerar inte hela omkopplingsprocessen nödvändigtvis det terminala metaboliska tillstånd som följer med neurodegeneration gradvis och irreversibelt, men våra data tyder på att det kan utgöra en underhållsneuron även i stadiet före celldöd (funktionell kompensationsmekanism). Detta fynd indikerar att neuroner har en betydande grad av metabolisk plasticitet i kroppen. Detta faktum bevisar att senare återinförande av MFN2 kan reversera uttrycket av viktiga metaboliska markörer och förhindra PN-degeneration. Tvärtom hämmar det ateroskleros och accelererar transsexuella nerver.
Ett av de mest fascinerande fynden i vår forskning är att PN:er som saknar OXPHOS kan modifiera TCA-cykelmetabolismen genom att uppreglera enzymer som specifikt stimulerar åderförkalkning. Metabolisk omorganisering är ett vanligt särdrag hos cancerceller, av vilka vissa är beroende av glutamin för att komplettera TCA-cykelmellanprodukter för att producera reducerande ekvivalenter, vilka driver andningskedjan och upprätthåller produktionen av lipid- och nukleotidbiosyntesprekursorer (39, 40). En nyligen genomförd studie visade att i perifera vävnader som upplever OXPHOS-dysfunktion är återkopplingen av glutamin/glutamatmetabolism också ett framträdande särdrag (5, 41), där riktningen för glutamins inträde i TCA-cykeln beror på på grund av svårighetsgraden av OXPHOS-skadan (41). Det saknas dock tydliga bevis för någon likhet mellan neuronal metabolisk plasticitet i kroppen och dess möjliga relevans i sjukdomssammanhang. I en nyligen genomförd in vitro-studie visades primära kortikala neuroner mobilisera glutamatpooler för neurotransmission, vilket därigenom främjar oxidativ metabolism och åderförkalkning under metabola stressförhållanden (42). Det är värt att notera att under farmakologisk hämning av TCA-cykelns enzym succinatdehydrogenas, tros pyruvatkarboxylering upprätthålla syntesen av oxaloacetat i odlade cerebellära granulneuroner (34). Emellertid har den fysiologiska relevansen av dessa mekanismer för hjärnvävnad (där ateroskleros tros huvudsakligen vara begränsad till astrocyter) fortfarande viktig fysiologisk betydelse (43). I detta fall visar våra data att PN som skadas av OXPHOS i kroppen kan omkopplas till BCAA-nedbrytning och pyruvatkarboxylering, vilka är de två huvudkällorna för tillskott av TCA-poolintermediärer. Även om det förmodade bidraget från BCAA-katabolism till neuronal energimetabolism har föreslagits, utöver glutamats och GABAs roll för neurotransmission (44), finns det fortfarande inga bevis för dessa mekanismer in vivo. Därför är det lätt att spekulera i att dysfunktionella PN automatiskt kan kompensera för konsumtionen av TCA-intermediärer som drivs av assimileringsprocessen genom att öka ateroskleros. I synnerhet kan uppreglering av PCx krävas för att upprätthålla en ökad efterfrågan på asparaginsyra, vilket föreslås i prolifererande celler med mitokondriell dysfunktion (45). Vår metabolomikanalys visade dock inga signifikanta förändringar i steady-state-nivån av asparaginsyra i Mfn2cKO PN (Figur S6A), vilket förmodligen återspeglar den olika metaboliska användningen av asparaginsyra mellan prolifererande celler och post-mitotiska neuroner. Även om den exakta mekanismen för PCx-uppreglering i dysfunktionella neuroner in vivo återstår att karakterisera, visade vi att detta för tidiga svar spelar en viktig roll för att upprätthålla redoxtillståndet hos neuroner, vilket demonstrerades i FLIM-experiment på cerebellära skivor. I synnerhet kan det att förhindra PN från att uppreglera PCx leda till ett mer oxiderat tillstånd och accelerera celldöd. Aktivering av BCAA-nedbrytning och karboxylering av pyruvat är inte sätt att karakterisera de perifera vävnaderna med mitokondriell dysfunktion (7). Därför verkar de vara en prioriterad egenskap hos OXPHOS-bristfälliga neuroner, även om de inte är den enda egenskapen, som är viktig för neurodegeneration.
Cerebellär sjukdom är en heterogen typ av neurodegenerativ sjukdom som vanligtvis manifesterar sig som ataxi och ofta skadar PN (46). Denna neuronpopulation är särskilt sårbar för mitokondriell dysfunktion eftersom deras selektiva degeneration hos möss är tillräcklig för att reproducera många av de motoriska symtom som kännetecknar mänsklig spinocerebellär ataxi (16, 47, 48). Enligt rapporter är en transgen musmodell med en mutantgen associerad med mänsklig spinocerebellär ataxi och har mitokondriell dysfunktion (49, 50), vilket betonar vikten av att studera konsekvenserna av OXPHOS-brist i PNPH. Därför är det särskilt lämpligt att effektivt isolera och studera denna unika neuronpopulation. Men med tanke på att PN är mycket känsliga för tryck och står för en låg andel av hela cerebellärcellpopulationen, är selektiv separation av dem som hela celler fortfarande en utmanande aspekt för många omikbaserade studier. Även om det är nästan omöjligt att uppnå absolut avsaknad av kontaminering av andra celltyper (särskilt vuxna vävnader), kombinerade vi ett effektivt dissociationssteg med FACS för att erhålla ett tillräckligt antal livskraftiga neuroner för proteomikanalys nedströms, och har en ganska hög proteintäckning (cirka 3000 proteiner) jämfört med den befintliga datamängden för hela lillhjärnan (51). Genom att bevara livskraften hos hela celler tillåter metoden vi tillhandahåller här oss inte bara att kontrollera förändringarna i de metaboliska vägarna i mitokondrierna, utan också att kontrollera förändringarna i dess cytoplasmatiska motsvarigheter, vilket kompletterar användningen av mitokondriella membrantaggar för att berika celltypen. Den nya metoden för antalet mitokondrier i komplexa vävnader (52, 53). Metoden vi beskriver är inte bara relaterad till studiet av Purkinjeceller, utan kan enkelt tillämpas på alla typer av celler för att hantera metaboliska förändringar i sjuka hjärnor, inklusive andra modeller av mitokondriell dysfunktion.
Slutligen har vi identifierat ett terapeutiskt fönster under denna metaboliska omorganiseringsprocess som helt kan reversera de viktigaste tecknen på cellulär stress och förhindra neuronal degeneration. Därför kan förståelsen av de funktionella implikationerna av den omkoppling som beskrivs här ge grundläggande insikter i möjliga behandlingar för att bibehålla neuronal livskraft under mitokondriell dysfunktion. Framtida forskning som syftar till att dissekera förändringar i energimetabolism i andra hjärncellstyper behövs för att fullt ut avslöja tillämpligheten av denna princip på andra neurologiska sjukdomar.
MitoPark-möss har beskrivits tidigare (31). C57BL/6N-möss med loxP-flankerande Mfn2-gener har beskrivits tidigare (18) och korsats med L7-Cre-möss (23). Den resulterande dubbelheterozygota avkomman korsades sedan med homozygota Mfn2loxP/Mfn2loxP-möss för att generera Purkinje-specifika genknockouts för Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). I en delmängd av parning introducerades Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP-allelen (stop-mtYFP) genom ytterligare korsningar (20). Alla djurförsök utfördes i enlighet med europeiska, nationella och institutionella riktlinjer och godkändes av LandesamtfürNatur of Umwelt and Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen, Tyskland. Djurförsök följer också riktlinjerna från European Federation of Laboratory Animal Sciences Associations.
Efter att den gravida kvinnans cervikala dislokation bedövats isolerades musembryot (E13). Cortex dissekerades i Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) kompletterad med 10 mM Hepes och överfördes till Dulbeccos Modified Eagle's Medium innehållande papain (20 U/ml) och cystein (1μg/ml). Vävnaden inkuberades i DMEM) och dissocierades genom enzymatisk digestion. (Ml) vid 37°C i 20 minuter och maldes sedan mekaniskt i DMEM kompletterat med 10 % fetalt bovint serum. Cellerna såddes på täckglas belagda med polylysin med en densitet av 2×106 per 6 cm odlingsskål eller med en densitet av 0,5×105 celler/cm2 för bildanalys. Efter 4 timmar ersattes mediet med Neurobasal serumfritt medium innehållande 1 % B27-tillskott och 0,5 mM GlutaMax. Neuronerna hölls sedan vid 37 °C och 5 % CO2 under hela experimentet och fick matas en gång i veckan. För att inducera rekombination in vitro användes 3 μl (odlingsskål med 24 brunnar) eller 0,5 μl (platta med 24 brunnar) av följande AAV9-virusvektor för att behandla neuroner den andra dagen in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, katalognummer 105530-AAV9) och AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, katalognummer 105545-AAV9).
Mus Mfn1- och Mfn2-komplementärt DNA (erhållet från Addgene-plasmid #23212 respektive #23213) är markerat med V5-sekvensen (GKPIPNPLLGLDST) vid C-terminalen och är fusionerade med mCherry i ram genom T2A-sekvensen. Grx1-roGFP2 är en gåva från Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Genom att ersätta tdTomato-kassetten med konventionella kloningsmetoder subklonades kassetten in i pAAV-CAG-FLEX-tdTomato-ryggraden (Addgene-referensnummer 28306) för att generera pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5-, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5- och pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2-vektorerna. En liknande strategi användes för att generera kontrollvektorn pAAV-CAG-FLEX-mCherry. För att generera AAV-shPCx-konstruktionen krävs en plasmid-AAV-vektor (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), vilken innehåller DNA-sekvensen som kodar för det shRNA som riktar sig mot mus-PCx (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGACGAAAG 3′). Under kontroll av U6-promotorn används mCherry under kontroll av CMV-promotorn. Produktionen av hjälp-AAV-vektorer utfördes enligt tillverkarens instruktioner (Cell Biolabs). Kort sagt, använd en överföringsplasmid som transient bär mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry). Transfektion av den kodande genen 293AAV-celler-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) eller Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2), samt kodande AAV1-kapsidprotein och accessoriskt protein. Förpackningsplasmidplasmid, med kalciumfosfatmetoden. Den råa virussupernatanten erhölls genom frys-tiningscykler i ett torris/etanolbad och lyserades cellerna i fosfatbuffrad saltlösning (PBS). AAV-vektorn renades genom diskontinuerlig jodixanolgradient-ultracentrifugering (24 timmar vid 32 000 rpm och 4 °C) och koncentrerades med ett Amicon ultra-15 centrifugalfilter. Genomtiter för AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9×1013 genomkopia (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX mättes som tidigare beskrivits (54), mätt med kvantitativ realtids-PCR (qPCR) -MFN1-V5 (1,9×1013 GC/ml) och AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9×1012 GC/ml).
Primära neuroner skrapades av i iskall 1x PBS, pelleterades och homogeniserades sedan i 0,5% Triton X-100 / 0,5% natriumdeoxikolat/PBS-lysbuffert innehållande fosfatas och proteashämmare (Roche). Proteinkvantifiering utfördes med hjälp av bicinkoninsyraanalys (Thermo Fisher Scientific). Proteinerna separerades sedan med SDS-polyakrylamidgelelektrofores och blottades sedan på ett polyvinylidenfluoridmembran (GE Healthcare). Blockera ospecifika ställen och inkubera med den primära antikroppen (se tabell S1 för detaljer) i 5% mjölk i TBST (Tris-buffrad saltlösning med Tween), tvättsteg och sekundär antikropp i TBST Incubate. Inkubera med primär antikropp över natten vid +4°C. Efter tvättning, applicera den sekundära antikroppen i 2 timmar vid rumstemperatur. Därefter, genom att inkubera samma blot med en anti-β-aktin-antikropp, bekräftades samma belastning. Detektion genom omvandling till kemiluminescens och förstärkning av kemiluminescens (GE Healthcare).
Neuronerna som tidigare såtts på täckglas fixerades med 4 % paraformaldehyd (PFA)/PBS vid den angivna tidpunkten i rumstemperatur i 10 minuter. Täckglasen permeeras först med 0,1 % Triton X-100/PBS i 5 minuter vid rumstemperatur och sedan i blockeringsbuffert [3 % bovint serumalbumin (BSA)/PBS]. På den andra dagen tvättades täckglasen med blockeringsbuffert och inkuberades med lämplig fluoroforkonjugerad sekundär antikropp i 2 timmar vid rumstemperatur; slutligen tvättades proverna noggrant i PBS med 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) motfärgad och fixerades sedan på objektglaset med Aqua-Poly/Mount.
Möss (hanar och honor) sövdes genom intraperitoneal injektion av ketamin (130 mg/kg) och xylazin (10 mg/kg) och administrerades subkutant med karprofenanalgetikum (5 mg/kg). De placerades i ett stereotaktiskt instrument (Kopf) utrustat med en varm dyna. Exponera skallen och använd en tandborr för att tunna ut den del av lillhjärnbarken som motsvarar mis-benet (från lambda: svans 1,8, lateral 1, motsvarande lobuli IV och V). Använd en böjd sprutnål för att försiktigt skapa ett litet hål i skallen för att undvika att störa kärlsystemet nedanför. Därefter förs den tunna, dragna glaskapillären långsamt in i mikrohålet (från -1,3 till -1 på den ventrala sidan av dura mater), och 200 till 300 nl AAV injiceras i mikroinjektorn (Narishige) med manuella sprutor (Narishige) flera gånger vid lågt tryck under en tidsperiod på 10 till 20 minuter. Efter infusionen, placera kapillärröret i ytterligare 10 minuter för att låta viruset spridas helt. Efter att kapillärerna har dragits bort sys huden noggrant för att minimera sårinflammation och låta djuret återhämta sig. Djuren behandlades med smärtstillande medel (caspofen) i flera dagar efter operationen, under vilken tid deras fysiska tillstånd övervakades noggrant och sedan avlivades de vid den angivna tidpunkten. Alla procedurer utfördes i enlighet med europeiska, nationella och institutionella riktlinjer och godkändes av LandesamtfürNatur of Umwelt and Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen, Tyskland.
Djuren sövdes med ketamin (100 mg/kg) och xylazin (10 mg/kg), och hjärtat perfunderades först med 0,1 M PBS och sedan med 4 % PFA i PBS. Vävnaden dissekerades och fixerades i 4 % PFA/PBS över natten vid 4 °C. En vibrerande kniv (Leica Microsystems GmbH, Wien, Österrike) användes för att framställa sagittala sektioner (50 μm tjocka) från den fixerade hjärnan i PBS. Om inget annat anges utfördes färgning av fritt flytande sektioner enligt beskrivningen ovan (13) vid rumstemperatur och omrörning. Kortfattat permeabiliserades först de erhållna skivorna med 0,5 % Triton X-100/PBS i 15 minuter vid rumstemperatur; för vissa epitoper (Pcx och Shmt2), genom att värma skivorna i tris-EDTA-buffert vid 80 °C (pH 9) i 25 minuter istället för detta steg. Därefter inkuberades snitten med primär antikropp (se tabell S1) i blockeringsbuffert (3 % BSA/PBS) vid 4 °C över natten under omrörning. Nästa dag tvättades snitten med blockeringsbuffert och inkuberades med lämplig fluoroforkonjugerad sekundär antikropp i 2 timmar vid rumstemperatur; slutligen tvättades snitten noggrant i PBS, motfärgades med DAPI och fixerades sedan med AquaPolymount på ett objektglas.
Ett laserskanningskonfokalmikroskop (TCS SP8-X eller TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) utrustat med en vit ljuslaser och en 405-diods ultraviolett laser användes för att avbilda provet. Genom att excitera fluoroforen och samla in signalen med Hybrid Detector (HyDs) användes LAS-X-programvara för att samla in staplade bilder som överensstämmer med Nyquist-sampling i sekventiellt läge: för icke-kvantitativa paneler är det mycket dynamiska signaler (till exempel i somatiska celler och dendriter) (mtYFP). Använd HyD för att detektera antalet PN i BrightR-läge). Gating från 0,3 till 6 ns tillämpas för att minska bakgrunden.
Realtidsavbildning av sorterade celler. Efter sortering i Neurobasal-A-medium innehållande 1 % B27-tillskott och 0,5 mM GlutaMax, såddes cellerna omedelbart på poly-l-lysin-belagda glasskivor (μ-Slide8 Well, Ibidi, katalognummer 80826). De hölls sedan vid 37 °C och 5 % CO2 i 1 timme för att låta cellerna sedimentera. Realtidsavbildning utfördes på ett Leica SP8 laserskanningskonfokalmikroskop utrustat med en vit laser, HyD, 63×[1,4 numerisk apertur (NA)] oljeobjektivlins och ett värmesteg.
Musen sövdes snabbt med koldioxid och halshöggs, hjärnan avlägsnades snabbt från skallen och skars i 200 μm tjocka (för 13C-märkningsexperimentet) eller 275 μm tjocka (för tvåfotonexperiment) sagittalsektioner fyllda med följande material. Glassen (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Tyskland) fylls med följande substanser: 125 mM iskall, kolmättad (95 % O2 och 5 % CO2) låg Ca2 + artificiell cerebrospinalvätska (ACSF) NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natriumfosfatbuffert, 25 mM NaHCO3, 25 mM glukos, 0,5 mM CaCl2 och 3,5 mM MgCl2 (osmotiskt tryck på 310 till 330 mmol). Överför de erhållna hjärnskivorna till en förinkubationskammare innehållande högre Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natriumfosfatbuffert, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukos, 1,0 mM CaCl2 och 2,0 mM MgCl2) Medium) pH 7,4 och 310 till 320 mmol).
Under avbildningsprocessen flyttades skivorna till ett dedikerat avbildningsrum, och experimentet utfördes under kontinuerlig ACSF-perfusion vid en konstant temperatur på 32° till 33°C. Ett multifotonlaserskanningsmikroskop (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) utrustat med en Leica 25x objektivlins (NA 0,95, vatten), Ti:Sapphire-laser (Chameleon Vision II, Coherent) användes för skivavbildning. FLIM-modul (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM av Grx1-roGFP2. Förändringarna i det cytoplasmatiska redoxtillståndet hos PN mättes med tvåfoton-FLIM i sagittala hjärnskivor, där Grx1-roGFP2-biosensorn riktade in sig på PN. I PN-lagret väljs förvärvsfältet cirka 50 till 80 μm under skivytan för att säkerställa att det finns ett livskraftigt PN (det vill säga avsaknaden av pärlstruktur eller neuronala morfologiska förändringar längs dendriterna) och den dubbelt positiva roGFP2-sensorn och AAV-kodande shRNA PCx eller dess kontrollsekvens (var och en samuttrycker mCherry). Samla in single-stack-bilder med 2x digital zoom [excitationsvåglängd: 890 nm; 512 nm 512 pixlar]. Detektion: intern HyD, fluoresceinisotiocyanat (FITC) filtergrupp] och bildmedelvärdesberäkning inom 2 till 3 minuter används för att säkerställa att tillräckligt med fotoner samlas in (totalt 1000 fotoner) för kurvanpassning. Känsligheten hos Grx1-roGFP2-proben och verifieringen av FLIM-förhållanden utfördes genom att övervaka livslängdsvärdet för roGFP2 när exogent 10 mM H2O2 tillsattes till perfusions-ACSF (för att maximera oxidation, vilket resulterar i ökad livslängd), och sedan tillsattes 2 mM ditiotreitol (minimerar reduktionsgraden, vilket resulterar i en minskning av livslängden) (Figur S8, D till G). Använd FLIMfit 5.1.1-programvaran för att analysera de erhållna resultaten, anpassa den enda exponentiella avklingningskurvan för hela bilden till den uppmätta IRF (instrumentresponsfunktion), och χ2 är ungefär 1. För att beräkna livslängden för en enda PN ritades masken runt nervkroppen manuellt, och den genomsnittliga livslängden i varje mask användes för kvantifiering.
Analys av mitokondriell potential. Efter att den akuta sektionen inkuberats med 100 nM TMRM direkt tillsatt till den perfunderade ACSF i 30 minuter, mättes förändringarna i mitokondriell potential hos PN med ett tvåfotonmikroskop. TMRM-avbildning utfördes genom att excitera sonden vid 920 nm och använda intern HyD (tetrametylrhodaminisotiocyanat: 585/40 nm) för att samla in signaler; genom att använda samma excitationsvåglängd men med en annan intern HyD (FITC: 525/50) för att avbilda mtYFP. Använd ImageJs Image Calculator-plugin för att utvärdera mitokondriell potential på enskild cellnivå. Kort sagt används plugin-ekvationen: signal = min (mtYFP, TMRM) för att identifiera den mitokondriella region som visar TMRM-signalen i Purkinje Somali i den konfokala bilden med en enda stapel av motsvarande kanal. Sedan kvantifieras pixelarean i den resulterande masken och normaliseras sedan på motsvarande tröskelbild med en enda stapel av mtYFP-kanalen för att erhålla den mitokondriella fraktionen som visar den mitokondriella potentialen.
Bilden dekonvolverades med Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) programvara. För de skannade bilderna av kakelplattor görs montaget av en enskild platta med hjälp av den automatiska sammanfogningsalgoritmen som tillhandahålls av LAS-X programvara. Efter bildkalibrering, använd ImageJ och Adobe Photoshop för att ytterligare bearbeta bilden och justera ljusstyrka och kontrast jämnt. Använd Adobe Illustrator för grafisk förberedelse.
mtDNA-fokusanalys. Antalet mtDNA-lesioner kvantifierades på cerebellära sektioner märkta med antikroppar mot DNA med konfokalmikroskop. Varje målområde skapades för cellkroppen och kärnan i varje cell, och respektive area beräknades med hjälp av Multi Measure-pluginet (ImageJ-programvara). Subtrahera kärnarean från cellkroppsarean för att erhålla den cytoplasmatiska arean. Slutligen användes Analyze Particles-pluginet (ImageJ-programvara) för att automatiskt kvantifiera de cytoplasmatiska DNA-punkterna som indikerar mtDNA på tröskelbilden, och de erhållna resultaten normaliserades till PN-medelvärdet för CTRL-möss. Resultaten uttrycks som det genomsnittliga antalet nukleosider per cell.
Analys av proteinuttryck. Använd ImageJs Image Calculator-plugin för att utvärdera proteinuttryck i PN på enskild cellnivå. Kort sagt, i den konfokala bilden i ett enda lager av motsvarande kanal, genom ekvationen: signal = min (mtYFP, antikropp), identifieras den mitokondriella region som visar immunreaktivitet mot en viss antikropp i Purkina. Sedan kvantifieras pixelarean i den resulterande masken och normaliseras sedan på motsvarande tröskelbild i en enda stapel av mtYFP-kanalen för att erhålla den mitokondriella fraktionen av det visade proteinet.
Analys av Purkinjecelldensitet. Insticksprogrammet Cell Counter till ImageJ användes för att utvärdera Purkinjedensitet genom att dividera antalet räknade Purkinjeceller med längden på den cerebellära ringen som upptas av de räknade cellerna.
Provberedning och insamling. Hjärnorna från kontrollgruppen och Mfn2cKO-möss fixerades i 2 % PFA/2,5 % glutaraldehyd i 0,1 M fosfatbuffert (PB), och sedan framställdes koronala sektioner med ciliater (Leica Mikrosysteme GmbH, Wien, Österrike) (tjocklek 50 till 60 μm). Fixerades sedan i PB-buffert i 1 % os-tetraoxid och 1,5 % kaliumferrocyanid vid rumstemperatur i 1 timme. Sektionerna tvättades tre gånger med destillerat vatten och färgades sedan med 70 % etanol innehållande 1 % uranylacetat i 20 minuter. Sektionerna dehydrerades sedan i graderad alkohol och inbäddades i Durcupan ACM (Araldite casting resin M) epoxiharts (Electron Microscopy Sciences, katalognummer 14040) mellan kiselbelagda glasskivor och polymeriserades slutligen vid 60 °C i ugn i 48 timmar. Området kring lillhjärnbarken valdes ut och 50 nm ultratunna snitt skars ut på Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Wien, Österrike) och plockades upp på ett 2×1 mm koppargaller belagt med polystyrenfilm. Snitten färgades med en lösning av 4 % uranylacetat i H2O i 10 minuter, tvättades med H2O flera gånger, sedan med Reynolds blycitrat i H2O i 10 minuter och tvättades sedan med H2O flera gånger. Mikrofotografier togs med ett transmissionselektronmikroskop Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) med en TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 digitalkamera (TVIPS GmbH, Gauting, USA, Tyskland).
För möss infekterade med AAV separerades hjärnan och skars i en 1 mm tjock sagittal sektion, och lillhjärnan undersöktes med hjälp av ett fluorescensmikroskop för att identifiera den AAV-infekterade ringen (det vill säga mCherry-uttryckande). Endast experiment där AAV-injektion resulterade i en mycket hög transduktionseffektivitet av Purkinjecellskiktet (dvs. nästan hela skiktet) i minst två på varandra följande lillhjärnsringar användes. Den AAV-transducerade slingan mikrodissekerades för fixering över natten (4% PFA och 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M kokatbuffert) och bearbetades vidare. För EPON-inbäddning tvättades den fixerade vävnaden med 0,1 M natriumkokatbuffert (Applichem) och inkuberades med 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) i 0,1 M natriumkokatbuffert (Applichem) i 4 timmar, tvättades sedan i 2 timmar. Upprepa 3 gånger med 0,1 M kokamidbuffert. Därefter användes den stigande serien etanol för att inkubera varje etanollösning vid 4 °C i 15 minuter för att dehydrera vävnaden. Vävnaden överfördes till propylenoxid och inkuberades över natten i EPON (Sigma-Aldrich) vid 4 °C. Placera vävnaden i färsk EPON vid rumstemperatur i 2 timmar och bädda sedan in den vid 62 °C i 72 timmar. Använd en ultramikrotom (Leica Microsystems, UC6) och en diamantkniv (Diatome, Biel, Schweiz) för att skära 70 nm ultratunna sektioner och färga med 1,5 % uranylacetat i 15 minuter vid 37 °C och färga med blycitratlösning i 4 minuter. Elektronmikrofotografierna togs med ett JEM-2100 Plus transmissionselektronmikroskop (JEOL) utrustat med Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) och DigitalMicrograph-programvara (Gatan). För analys togs elektronmikroskopbilder med 5000× eller 10 000× digital zoom.
Morfologisk analys av mitokondrier. För alla analyser skisserades konturerna av individuella mitokondrier manuellt i digitala bilder med hjälp av ImageJ-programvaran. Olika morfologiska parametrar analyseras. Mitokondrietätheten uttrycks som en procentandel som erhålls genom att dividera den totala mitokondriella arean för varje cell med cytoplasmaarean (cytoplasmaarea = cellarea-cellkärnaarea) × 100. Mitokondriernas rundhet beräknas med formeln [4π∙(area/perimeter 2)]. Mitokondriernas ista-morfologi analyserades och delades in i två kategorier ("tubulär" och "blåseformad") enligt deras huvudsakliga former.
Analys av antal och densitet av autofagosomer/lysosomer. Använd ImageJ-programvaran för att manuellt skissera konturerna för varje autofagosom/lysosom i den digitala bilden. Autofagosom-/lysosomarean uttrycks som en procentandel beräknad genom att dividera den totala autofagosom-/lysosomstrukturarean för varje cell med cytoplasmarean (cytoplasmaarea = cellarea-kärnaarea) × 100. Densiteten av autofagosomer/lysosomer beräknas genom att dividera det totala antalet med antalet autofagosom-/lysosomstrukturer per cell (i termer av cytoplasmaarea) (cytoplasmaarea = cellarea-kärnaarea).
Märkning för akut sektionering och provberedning. För experiment som kräver glukosmärkning, överför de akuta hjärnskivorna till en förinkubationskammare, som innehåller mättat kol (95 % O2 och 5 % CO2), ACSF med hög Ca2+-halt (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natriumfosfatbuffert, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukos, 1,0 mM CaCl2 och 2,0 mM MgCl2, justerat till pH 7,4 och 310 till 320 mOsm), där glukos är 13C6-glukossubstitution (Eurisotop, katalognummer CLM-1396). För experiment som kräver pyruvatmärkning, överför de akuta hjärnskivorna till högre Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natriumfosfatbuffert, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukos, 1,0 mM CaCl2 och tillsätt 2,0 mM MgCl2, justera pH till 7,4 och 310 till 320 mOsm), och tillsätt 1 mM 1-[1-13C]pyruvat (Eurisotop, katalognummer CLM-1082). Inkubera snitten i 90 minuter vid 37 °C. Vid slutet av experimentet tvättades snitten snabbt med en vattenlösning (pH 7,4) innehållande 75 mM ammoniumkarbonat och homogeniserades sedan i 40:40:20 (v:v:v) acetonitril (ACN): metanol:vatten. Efter att snitten inkuberats på is i 30 minuter centrifugerades proverna vid 21 000 g i 10 minuter vid 4 °C, och den klara supernatanten torkades i en SpeedVac-koncentrator. Den resulterande torkade metabolitpelleten förvarades vid -80 °C fram till analys.
Vätskekromatografi-masspektrometrianalys av 13C-märkta aminosyror. För vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS)-analys resuspenderades metabolitpelleten i 75 μl vatten av LC-MS-kvalitet (Honeywell). Efter centrifugering vid 21 000 g i 5 minuter vid 4 °C användes 20 μl av den klargjorda supernatanten för aminosyraflödesanalys, medan resten av extraktet omedelbart användes för anjonanalys (se nedan). Aminosyraanalys utfördes med hjälp av det tidigare beskrivna bensoylkloridderivatiseringsprotokollet (55, 56). I det första steget tillsattes 10 μl 100 mM natriumkarbonat (Sigma-Aldrich) till 20 μl metabolitextrakt, och sedan tillsattes 10 μl 2 % bensoylklorid (Sigma-Aldrich) till ACN av LC-kvalitet. Provet vortexades kort och centrifugerades sedan vid 21 000 g i 5 minuter vid 20 °C. Överför den klara supernatanten till en 2 ml autosampler-ampull med en konisk glasinsats (200 μl volym). Proverna analyserades med hjälp av Acquity iClass ultrahögpresterande LC-system (Waters) anslutet till Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) högupplösande precisionsmasspektrometer (Thermo Fisher Scientific). För analys injicerades 2 μl av det derivatiserade provet i en 100×1,0 mm höghållfast kiseldioxid T3-kolonn (Waters) innehållande 1,8 μm partiklar. Flödeshastigheten är 100 μl/min, och buffertsystemet består av buffert A (10 mM ammoniumformiat och 0,15 % myrsyra i vatten) och buffert B (ACN). Gradienten är följande: 0 % B vid 0 minuter; 0 % B. 0 till 15 % B vid 0 till 0,1 minuter; 15 till 17 % B vid 0,1 till 0,5 minuter; B vid 17 till 55 % vid 0,5 till 14 minuter; B vid 55 till 70 % vid 14 till 14,5 minuter; vid 14,5 till 70 till 100 % B vid 18 minuter; 100 % B vid 18 till 19 minuter; 100 till 0 % B vid 19 till 19,1 minuter; 0 % B vid 19,1 till 28 minuter (55, 56). Masspektrometern QE-HF arbetar i positiv joniseringsläge med ett massområde m/z (massa/laddningsförhållande) på 50 till 750. Den tillämpade upplösningen är 60 000, och det erhållna förstärkningsreglerade (AGC) jonmålet är 3×106, och den maximala jontiden är 100 millisekunder. Den uppvärmda elektrosprayjoniseringskällan (ESI) arbetar med en sprayspänning på 3,5 kV, en kapillärtemperatur på 250 °C, ett mantelluftflöde på 60 AU (godtyckliga enheter) och ett hjälpluftflöde på 20 AU till 250 °C. S-linsen är inställd på 60 AU.
Anjonkromatografi-MS-analys av 13C-märkta organiska syror. Den återstående metabolitfällningen (55 μl) analyserades med hjälp av ett Dionex-jonkromatografisystem (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) anslutet till en QE-HF-masspektrometer (Thermo Fisher Scientific). Kortfattat injicerades 5 μl metabolitextrakt i en Dionex IonPac AS11-HC-kolonn utrustad med HPLC (2 mm × 250 mm, partikelstorlek 4 μm, Thermo Fisher Scientific) i push-in partial loop-läge med ett fyllningsförhållande på 1. Dionex IonPac AG11-HC skyddskolonn (2 mm x 50 mm, 4 μm, Thermo Fisher Scientific). Kolonntemperaturen hålls vid 30 °C och autosamplern är inställd på 6 °C. Använd en kaliumhydroxidpatron med avjoniserat vatten för att generera en kaliumhydroxidgradient genom eluentgeneratorn. Separation av metaboliter vid en flödeshastighet av 380 μl/min, med tillämpning av följande gradient: 0 till 3 minuter, 10 mM KOH; 3 till 12 minuter, 10 till 50 mM KOH; 12 till 19 minuter, 50 till 100 mM KOH; 19 till 21 minuter, 100 mM KOH; 21 till 21,5 minuter, 100 till 10 mM KOH. Kolonnen återjämviktades under 10 mM KOH i 8,5 minuter.
De eluerade metaboliterna kombineras med en ström av 150 μl/min isopropanoltillskott efter kolonnen och leds sedan till en högupplösande masspektrometer som arbetar i negativ joniseringsläge. MS övervakar massområdet från m/z 50 till 750 med en upplösning på 60 000. AGC är inställd på 1×106, och den maximala jontiden hålls vid 100 ms. Den uppvärmda ESI-källan drevs med en sprayspänning på 3,5 kV. De andra inställningarna för jonkällan är följande: kapillärtemperatur 275 °C; mantelgasflöde, 60 AU; hjälpgasflöde, 20 AU vid 300 °C, och S-linsinställning till 60 AU.
Dataanalys av 13C-märkta metaboliter. Använd TraceFinder-programvara (version 4.2, Thermo Fisher Scientific) för dataanalys av isotopförhållandet. Identiteten för varje förening verifierades med en pålitlig referensförening och analyserades oberoende. För att utföra isotopanrikningsanalys extraherades arean av det extraherade jonkromatogrammet (XIC) för varje 13C-isotop (Mn) från [M + H]+, där n är kolatomantalet för målföreningen, som används för att analysera aminosyror eller [MH]+ som används för att analysera anjoner. Massnoggrannheten för XIC är mindre än fem miljondelar, och noggrannheten för RT är 0,05 minuter. Anrikningsanalysen utförs genom att beräkna förhållandet mellan varje detekterad isotop och summan av alla isotoper av motsvarande förening. Dessa förhållanden anges som procentvärden för varje isotop, och resultaten uttrycks som molär procentuell anrikning (MPE), såsom beskrivits tidigare (42).
Den frysta neuronpelleten homogeniserades i iskall 80 % metanol (v/v), virvlades och inkuberades vid -20 °C i 30 minuter. Virvlade provet igen och rör om vid +4 °C i 30 minuter. Provet centrifugerades vid 21 000 g i 5 minuter vid 4 °C, och sedan samlades den resulterande supernatanten upp och torkades med en SpeedVac-koncentrator vid 25 °C för efterföljande analys. Som beskrivits ovan utfördes LC-MS-analys på aminosyrorna i de sorterade cellerna. Med hjälp av TraceFinder (version 4.2, Thermo Fisher Scientific) utfördes dataanalys med den monoisotopiska massan av varje förening. Kvantilnormalisering av metabolitdata utfördes med hjälp av preprocessCore-programvarupaketet (57).
Snittberedning. Musen sövdes snabbt med koldioxid och halshöggs, hjärnan avlägsnades snabbt från skallen och den isfyllda vibrerande kniven (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Tyskland) användes för att skära den i sagittala sektioner på 300 till 375 μm. Kall kolförgasning (95 % O2 och 5 % CO2) Låg Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natriumfosfatbuffert, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukos, 1,0 mM CaCl2 och 6,0 mM MgCl2. Justera till pH 7,4 och 310 till 330 mOsm). Överför de erhållna hjärnskivorna till en kammare innehållande högre Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natriumfosfatbuffert, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukos, 4,0 mM CaCl2 och mM 3,5 MgCl2) pH 7,4 och 310 till 320 mOsm). Förvara skivorna i 20 till 30 minuter så att de kan återställas före inspelning.
inspelning. Ett mikroskopbord utrustat med en fast inspelningskammare och en 20x vattenimmersionslins (Scientifica) användes för alla inspelningar. De förmodade Purkinjecellerna identifierades genom (i) kroppsstorlek, (ii) lillhjärnans anatomiska placering och (iii) uttryck av den fluorescerande mtYFP-reportergenen. Patchpipetten med ett spetsmotstånd på 5 till 11 megohm dras ut med hjälp av en kapillär av borsilikatglas (GB150-10, 0,86 mm × 1,5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, Tyskland) och en horisontell pipett från Instruments (P-1000, Sutter), Novato, Kalifornien). Alla inspelningar utfördes med ELC-03XS npi patch clamp amplifier (npi electronic GmbH, Tam, Tyskland), som styrdes av programvaran Signal (version 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, Storbritannien). Experimentet spelades in med en samplingsfrekvens på 12,5 kHz. Signalen filtreras med två kortpass Bessel-filter med gränsfrekvenser på 1,3 respektive 10 kHz. Membranets och pipettens kapacitans kompenseras av kompensationskretsen med hjälp av förstärkaren. Alla experiment utfördes under kontroll av en Orca-Flash 4.0-kamera (Hamamatsu, Gerden, Tyskland), som styrdes av Hokawo-programvaran (version 2.8, Hamamatsu, Gerden, Tyskland).
Rutinmässig helcellskonfiguration och analys. Omedelbart före registrering, fyll pipetten med den interna lösningen innehållande följande substanser: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM kaliumglukonat, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM ATP (Mg), 0,5 mM Guanosintrifosfat (GTP) (Na) och 10,0 mM kreatininfosfat justerades till pH 7,25, och det osmotiska trycket var 290 mOsm (sackaros). Omedelbart efter att en kraft på 0 pA applicerats för att spränga membranet mättes vilomembranpotentialen. Ingångsresistansen mäts genom att applicera hyperpolariserade strömmar på -40, -30, -20 och -10 pA. Mät storleken på spänningsresponsen och använd Ohms lag för att beräkna ingångsresistansen. Spontan aktivitet registrerades i en spänningstång i 5 minuter, och sPSC identifierades och mättes i Igor Pro (version 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) med hjälp av ett halvautomatiskt igenkänningsskript. IV-kurvan och stationär ström mäts genom att klämma fast batteriet vid olika potentialer (från -110 mV) och öka spänningen i steg om 5 mV. Produktionen av AP testades genom att applicera en depolariserande ström. Kläm fast cellen vid -70 mV samtidigt som en depolariserande strömpuls appliceras. Justera stegstorleken för varje registreringsenhet separat (10 till 60 pA). Beräkna den maximala AP-frekvensen genom att manuellt räkna pulstopparna som orsakar den högsta AP-frekvensen. AP-tröskeln analyseras med hjälp av den andra derivatan av depolarisationspulsen som först utlöser en eller flera AP:er.
Konfiguration och analys av perforerad patch. Utför perforerad patchregistrering med standardprotokoll. Använd en ATP- och GTP-fri pipett som inte innehåller följande ingredienser: 128 mM glukonat K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0,1 mM EGTA och 2 mM MgCl2, och justera till pH 7,2 (med KOH). ATP och GTP utelämnas från den intracellulära lösningen för att förhindra okontrollerad permeabilitet av cellmembranet. Patchpipetten fylls med en amfotericininnehållande intern lösning (cirka 200 till 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) för att erhålla en stansad patchregistrering. Amfotericin löstes i dimetylsulfoxid (slutkoncentration: 0,1 till 0,3 %; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Koncentrationen av DMSO som användes hade ingen signifikant effekt på de studerade neuronerna. Under stansningsprocessen övervakades kanalresistansen (Ra) kontinuerligt, och experimentet startades efter att amplituden för Ra och AP stabiliserats (20–40 minuter). Spontan aktivitet mäts i en spännings- och/eller strömtång i 2 till 5 minuter. Dataanalys utfördes med Igor Pro (version 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (version 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) och GraphPad Prism (version 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). För att identifiera spontana AP:er används IgorPros insticksprogram NeuroMatic v3.0c. Identifiera AP:er automatiskt med hjälp av ett givet tröskelvärde, vilket justeras individuellt för varje post. Använd spikintervallet för att bestämma spikfrekvensen med den maximala momentana spikfrekvensen och den genomsnittliga spikfrekvensen.
PN-isolering. Genom att anpassa sig till det tidigare publicerade protokollet renades PN från muslång hjärna vid ett specificerat stadium (58). Kortfattat dissekerades och finhackades hjärnan i iskallt dissociationsmedium [utan HBSS Ca2+ och Mg2+, kompletterat med 20 mM glukos, penicillin (50 U/ml) och streptomycin (0,05 mg/ml)], och sedan digererades mediet i papain [HBSS, kompletterat med 1-cystein·HCl (1 mg/ml), papain (16 U/ml) och deoxiribonukleas I (DNase I; 0,1 mg/ml)]. Behandla i 30 minuter vid 30°C. Tvätta först vävnaderna i HBSS-medium innehållande äggslem (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) och DNas (0,1 mg/ml) vid rumstemperatur för att förhindra enzymatisk nedbrytning, och sedan i HBSS-medium innehållande 20 mM glukos. Försiktigt malning av HBSS, penicillin (50 U/ml), streptomycin (0,05 mg/ml) och DNas (0,1 mg/ml) frisatte enskilda celler. Den resulterande cellsuspensionen filtrerades genom en 70 μm cellsil, sedan pelleterades cellerna genom centrifugering (1110 rpm, 5 minuter, 4°C) och resuspenderades i sorteringsmedium [HBSS, kompletterat med 20 mM glukos, 20 % fetalt bovint serum, penicillin (50 U/ml) och streptomycin (0,05 mg/ml)]; utvärdera cellviabiliteten med propidiumjodid och justera celldensiteten till 1×10⁶ till 2×10⁶ celler/ml. Före flödescytometri filtrerades suspensionen genom en 50 μm cellfilter.
Flödescytometer. Cellsortering utfördes vid 4 °C med hjälp av FACSAria III-maskin (BD Biosciences) och FACSDiva-programvara (BD Biosciences, version 8.0.1). Cellsuspensionen sorterades med ett 100 μm munstycke under ett tryck på 20 psi med en hastighet av ~2800 händelser/sek. Eftersom traditionella gatingkriterier (cellstorlek, bimodal diskriminering och spridningsegenskaper) inte kan säkerställa korrekt isolering av PN från andra celltyper, sätts gatingstrategin baserat på en direkt jämförelse av YFP-intensiteten och autofluorescensen hos mitoYFP+ ​​och kontroll-mitoYFP−-möss. YFP exciteras genom att provet bestrålas med en 488 nm laserlinje, och signalen detekteras med ett 530/30 nm bandpassfilter. Hos mitoYFP+-möss används även den relativa styrkan hos Rosa26-mitoYFP-reportergenen för att särskilja neuronala kroppar och axonfragment. 7-AAD exciteras med en 561 nm gul laser och detekteras med ett 675/20 nm bandpassfilter för att exkludera döda celler. För att separera astrocyter samtidigt färgades cellsuspensionen med ACSA-2-APC, sedan bestrålades provet med en 640 nm laserlinje och ett 660/20 nm bandpassfilter användes för att detektera signalen.
De insamlade cellerna pelleterades genom centrifugering (1110 rpm, 5 minuter, 4 °C) och förvarades vid -80 °C fram till användning. Mfn2cKO-möss och deras kullvalpar klassificeras samma dag för att minimera procedurvariabilitet. FACS-datapresentation och analys utfördes med hjälp av FlowJo-programvara (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA).
Som nämnts ovan (59) används realtids-PCR för att isolera DNA från de sorterade neuronerna för efterföljande mtDNA-kvantifiering. Linjäriteten och tröskelkänsligheten testades initialt genom att köra qPCR på olika antal celler. Kort sagt, samla in 300 PN i en lysbuffert bestående av 50 mM tris-HCl (pH 8,5), 1 mM EDTA, 0,5 % Tween 20 och proteinas K (200 ng/ml) och inkubera vid 55 °C i 120 minuter. Cellerna inkuberades ytterligare vid 95 °C i 10 minuter för att säkerställa fullständig inaktivering av proteinas K. Med hjälp av en TaqMan-sond (Thermo Fisher) specifik för mt-Nd1 mättes mtDNA med semi-kvantitativ PCR i 7900HT realtids-PCR-systemet (Thermo Fisher Scientific). Science, katalognummer Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, katalognummer AIVI3E8) och 18S (Thermo Fisher Scientific, katalognummer Hs99999901_s1) gener.
Beredning av proteomprov. Genom att värma lösningen vid 95 °C i 10 minuter och sonikera i lysbuffert [6 M guanidinklorid, 10 mM tris(2-karboxietyl)fosfinhydroklorid, 10 mM kloracetamid och 100 mM tris-Lys frysta neuronpellets i HCl]. På Bioruptor (Diagenode) i 10 minuter (30 sekunder puls / 30 sekunder pausperiod). Provet späddes 1:10 i 20 mM tris-HCl (pH 8,0), blandades med 300 ng trypsin-guld (Promega) och inkuberades över natten vid 37 °C för att uppnå fullständig digestion. På den andra dagen centrifugerades provet vid 20 000 g i 20 minuter. Supernatanten späddes med 0,1 % myrsyra och lösningen avsaltades med hemmagjorda StageTips. Provet torkades i ett SpeedVac-instrument (Eppendorf-koncentrator plus 5305) vid 45 °C, och sedan suspenderades peptiden i 0,1 % myrsyra. Alla prover framställdes samtidigt av samma person. För att analysera astrocytprover märktes 4 μg avsaltade peptider med en tandem-massmärkning (TMT10plex, katalognummer 90110, Thermo Fisher Scientific) med ett förhållande mellan peptid och TMT-reagens på 1:20. För TMT-märkning resuspenderades 0,8 mg TMT-reagens i 70 μl vattenfri ACN, och den torkade peptiden rekonstituerades i 9 μl 0,1 M TEAB (trietylammoniumbikarbonat), till vilket 7 μl TMT-reagens i ACN tillsattes. Koncentrationen var 43,75 %. Efter 60 minuters inkubation avbröts reaktionen med 2 μl 5 % hydroxylamin. De märkta peptiderna samlades in, torkades, resuspenderades i 200 μl 0,1 % myrsyra (FA), delades i två delar och avsaltades sedan med hjälp av hemmagjorda StageTips. Med hjälp av UltiMate 3000 ultrahögpresterande vätskekromatograf (UltiMate 3000 ultrahögpresterande vätskekromatograf) fraktionerades en av de två halvorna på en 1 mm x 150 mm Acquity kromatografisk kolonn fylld med 130 Å1,7 μm C18-partiklar (Waters, katalognr. SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Separera peptiderna med en flödeshastighet av 30 μl/min, separera från 1 % till 50 % buffert B i 85 minuter med en stegvis gradient på 96 minuter, från 50 % till 95 % buffert B i 3 minuter, sedan 8 minuter för 95 % buffert B; Buffert A är 5 % ACN och 10 mM ammoniumbikarbonat (ABC), och buffert B är 80 % ACN och 10 mM ABC. Samla in fraktionerna var tredje minut och kombinera dem i två grupper (1 + 17, 2 + 18, etc.) och torka dem i en vakuumcentrifug.
LC-MS/MS-analys. För masspektrometri separerades peptiderna (nummer r119.aq) på en 25 cm, 75 μm innerdiameter PicoFrit-analyskolonn (ny objektivlins, artikelnummer PF7508250) utrustad med 1,9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ-medium (Dr. Maisch, mat), använd EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Tyskland). Kolonnen hölls vid 50 °C. Buffertarna A och B är 0,1 % myrsyra i vatten respektive 0,1 % myrsyra i 80 % ACN. Peptiderna separerades från 6 % till 31 % buffert B i 65 minuter och från 31 % till 50 % buffert B i 5 minuter med en gradient på 200 nl/min. De eluerade peptiderna analyserades på en Orbitrap Fusion-masspektrometer (Thermo Fisher Scientific). Peptidprekursor m/z-mätning utförs med en upplösning på 120 000 i intervallet 350 till 1500 m/z. Med 27 % normaliserad kollisionsenergi väljs den starkaste prekursorn med ett laddningstillstånd på 2 till 6 för högenergiklyvning med C-fälldissociation (HCD). Cykeltiden är satt till 1 s. M/z-värdet för peptidfragmentet mättes i jonfällan med det minsta AGC-målet på 5×104 och den maximala injektionstiden på 86 ms. Efter fragmenteringen placerades prekursorn på den dynamiska exklusionslistan i 45 s. TMT-märkta peptider separerades på en 50 cm, 75 μm Acclaim PepMap-kolonn (Thermo Fisher Scientific, katalognummer 164942), och migrationsspektra analyserades på en Orbitrap Lumos Tribrid-masspektrometer (Thermo Fisher Scientific) utrustad med högfälts-asymmetriska vågformjoner (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific) som arbetar vid två kompensationsspänningar på −50 och −70 V. MS3 vald baserat på synkroniseringsprekursorn används för TMT-rapportjonsignalmätning. Peptidseparationen utfördes på EASY-nLC 1200, med en 90 % linjär gradienteluering, med en buffertkoncentration på 6 % till 31 %; buffert A var 0,1 % FA och buffert B var 0,1 % FA och 80 % ACN. Den analytiska kolonnen drivs vid 50 °C. Använd FreeStyle (version 1.6, Thermo Fisher Scientific) för att dela originalfilen enligt FAIMS-kompensationsspänningen.
Proteinidentifiering och kvantifiering. Med hjälp av den integrerade Andromeda-sökmotorn analyserades originaldata med MaxQuant version 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Förutom Cre-rekombinas- och YFP-sekvenserna erhållna från Aequorea victoria, söktes peptidfragmentspektra efter den kanoniska sekvensen och isoformsekvensen för musreferensproteomet (Proteom-ID UP000000589, nedladdat från UniProt i maj 2017). Metioninoxidation och protein N-terminal acetylering sattes som variabla modifieringar; cysteinkarbamoylmetylering sattes som fasta modifieringar. Digesteringsparametrarna är inställda på "specificitet" och "trypsin/P". Minsta antal peptider och rakelpeptider som används för proteinidentifiering är 1; minsta antal unika peptider är 0. Under förhållandena för peptidkartmatchning var proteinidentifieringshastigheten 0,01. Alternativet "Andra peptid" är aktiverat. Använd alternativet "match between runs" för att överföra lyckade identifieringar mellan olika originalfiler. Använd LFQ minimum ratio count 1 för etikettfri kvantifiering (LFQ) (60). LFQ-intensiteten filtreras för minst två giltiga värden i minst en genotypgrupp vid varje tidpunkt och extrapoleras från en normalfördelning med en bredd på 0,0,3 och flyttas nedåt 1,8. Använd Perseus computing platform (https://maxquant.net/perseus/) och R (https://r-project.org/) för att analysera LFQ-resultaten. Ett tvåvägs moderat t-test från limma-programvarupaketet användes för differentiell uttrycksanalys (61). Explorativ dataanalys utförs med ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally och pheatmap. De TMT-baserade proteomikdata analyserades med MaxQuant version 1.6.10.43. Sök efter rådata för proteomik från UniProts databas för humana proteomik, som laddades ner i september 2018. Analysen inkluderar den korrektionsfaktor för isotoprenhet som tillhandahålls av tillverkaren. Använd limma i R för differentiell uttrycksanalys. Originaldata, databassökningsresultat och dataanalysarbetsflöde och resultat lagras alla i ProteomeXchange-alliansen via PRIDE-partnerförrådet med datamängdsidentifieraren PXD019690.
Funktionella annoteringar berikar analysen. QIAGEN-verktyget (Ingenuity Pathway Analysis) användes för att bestämma rikedomen hos de funktionella annoteringstermerna i datamängden vid 8 veckor (Figur 1). Kort sagt används den kvantitativa proteinlistan som erhållits från LC-MS/MS (tandemmasspektrometri) dataanalys med följande filterkriterier: Mus musculus väljs som art och bakgrund, och kategorin visar att P-värdet justerat av Benjamini för anrikning 0,05 eller lägre anses signifikant. För denna graf visas de fem största överskottskategorierna i varje kluster baserat på det justerade P-värdet. Med hjälp av multipelt t-test, med hjälp av det tvåstegs linjära boost-programmet från Benjamini, Krieger och Yekutieli (Q = 5 %), utförs tidsförloppsproteinuttrycksanalys på de viktiga kandidater som identifierats i varje kategori, och varje rad analyseras separat. Det finns inget behov av att anta en konsekvent standardavvikelse.
För att jämföra resultaten från denna studie med publicerade databaser och generera ett Venn-diagram i figur 1, kombinerade vi den kvantitativa proteinlistan med MitoCarta 2.0-annoteringar (24). Använd onlineverktyget Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) för att generera diagrammet.
För detaljerad information om de statistiska procedurer som används för proteomikanalys, se motsvarande avsnitt i Material och metoder. För alla andra experiment finns detaljerad information i motsvarande förklaring. Om inget annat anges uttrycks alla data som medelvärde ± SEM, och alla statistiska analyser utfördes med hjälp av GraphPad Prism 8.1.2-programvaran.
För kompletterande material till den här artikeln, se http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Detta är en artikel med öppen åtkomst som distribueras under villkoren i Creative Commons Attribution-Non-Commercial-licensen, som tillåter användning, distribution och reproduktion i vilket medium som helst, så länge den slutliga användningen inte är för kommersiell vinning och förutsättningen är att originalverket är korrekt. Referens.
Obs: Vi ber dig bara att ange din e-postadress så att personen du rekommenderar till sidan vet att du vill att de ska se e-postmeddelandet och att det inte är skräppost. Vi kommer inte att samla in några e-postadresser.
Den här frågan används för att testa om du är en besökare och förhindra automatisk spam.
Av E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Proteomanalys av dysfunktionella neuroner visade att metaboliska program aktiveras för att motverka neurodegeneration.
Av E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Proteomanalys av dysfunktionella neuroner visade att metaboliska program aktiveras för att motverka neurodegeneration.
©2020 American Association for the Advancement of Science. alla rättigheter reserverade. AAAS är partner till HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef och COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.