Artikeln är en del av forskningsämnet ”Avancerade bioremedieringstekniker och återvinningsprocesser för syntetiska organiska föreningar (SOC). Visa alla 14 artiklar
Lågmolekylära polycykliska aromatiska kolväten (PAH) såsom naftalen och substituerade naftalener (metylnaftalen, naftoesyra, 1-naftyl-N-metylkarbamat, etc.) används i stor utsträckning inom olika industrier och är genotoxiska, mutagena och/eller cancerframkallande för organismer. Dessa syntetiska organiska föreningar (SOC) eller xenobiotika anses vara prioriterade föroreningar och utgör ett allvarligt hot mot den globala miljön och folkhälsan. Intensiteten av mänskliga aktiviteter (t.ex. kolförgasning, oljeraffinering, fordonsutsläpp och jordbruksapplikationer) avgör koncentrationen, ödet och transporten av dessa allestädes närvarande och persistenta föreningar. Förutom fysikaliska och kemiska behandlings-/borttagningsmetoder har gröna och miljövänliga tekniker såsom bioremediering, som använder mikroorganismer som kan bryta ner POC:er helt eller omvandla dem till giftfria biprodukter, framstått som ett säkert, kostnadseffektivt och lovande alternativ. Olika bakteriearter som tillhör fylan Proteobacteria (Pseudomonas, Pseudomonas, Comamonas, Burkholderia och Neosphingobacterium), Firmicutes (Bacillus och Paenibacillus) och Actinobacteria (Rhodococcus och Arthrobacter) i markens mikrobiota har visat förmågan att bryta ner olika organiska föreningar. Metaboliska studier, genomik och metagenomisk analys hjälper oss att förstå den kataboliska komplexiteten och mångfalden som finns i dessa enkla livsformer, vilket kan tillämpas vidare för effektiv biologisk nedbrytning. Den långvariga förekomsten av PAH:er har resulterat i framväxten av nya nedbrytningsfenotyper genom horisontell genöverföring med hjälp av genetiska element såsom plasmider, transposoner, bakteriofager, genomiska öar och integrativa konjugativa element. Systembiologi och genteknik av specifika isolat eller modellsamhällen (konsortier) kan möjliggöra omfattande, snabb och effektiv bioremediering av dessa PAH:er genom synergistiska effekter. I denna översikt fokuserar vi på de olika metaboliska vägarna och mångfalden, genetisk sammansättning och mångfald, samt cellulära svar/anpassningar hos naftalen och substituerade naftalen-nedbrytande bakterier. Detta kommer att ge ekologisk information för fältanvändning och stamoptimering för effektiv bioremediering.
Snabb utveckling av industrier (petrokemikalier, jordbruk, läkemedel, textilfärger, kosmetika etc.) har bidragit till globalt ekonomiskt välstånd och förbättrad levnadsstandard. Denna exponentiella utveckling har resulterat i produktionen av ett stort antal syntetiska organiska föreningar (SOC), som används för att tillverka olika produkter. Dessa främmande föreningar eller SOC inkluderar polycykliska aromatiska kolväten (PAH), bekämpningsmedel, herbicider, mjukgörare, färgämnen, läkemedel, organofosfater, flamskyddsmedel, flyktiga organiska lösningsmedel etc. De släpps ut i atmosfären, akvatiska och terrestra ekosystem där de har flerdimensionell påverkan och orsakar skadliga effekter på olika bioformer genom förändring av fysikalisk-kemiska egenskaper och samhällsstruktur (Petrie et al., 2015; Bernhardt et al., 2017; Sarkar et al., 2020). Många aromatiska föroreningar har starka och destruktiva effekter på många intakta ekosystem/biodiversitetshotspots (t.ex. korallrev, arktiska/antarktiska inlandsisar, höga bergssjöar, djuphavssediment, etc.) (Jones 2010; Beyer et al. 2020; Nordborg et al. 2020). Nyligen genomförda geomikrobiologiska studier har visat att avsättning av syntetiskt organiskt material (t.ex. aromatiska föroreningar) och deras derivat på ytorna av konstgjorda strukturer (bebyggd miljö) (t.ex. kulturarvsplatser och monument gjorda av granit, sten, trä och metall) påskyndar deras nedbrytning (Gadd 2017; Liu et al. 2018). Mänskliga aktiviteter kan intensifiera och förvärra den biologiska nedbrytningen av monument och byggnader genom luftföroreningar och klimatförändringar (Liu et al. 2020). Dessa organiska föroreningar reagerar med vattenånga i atmosfären och sätter sig på strukturen, vilket orsakar fysisk och kemisk nedbrytning av materialet. Biologisk nedbrytning är allmänt erkänt som oönskade förändringar i materials utseende och egenskaper orsakade av levande organismer som påverkar deras bevarande (Pochon och Jaton, 1967). Ytterligare mikrobiell verkan (metabolism) av dessa föreningar kan minska strukturell integritet, bevarandeeffektivitet och kulturellt värde (Gadd, 2017; Liu et al., 2018). Å andra sidan har mikrobiell anpassning till och respons på dessa strukturer i vissa fall visat sig vara fördelaktigt eftersom de bildar biofilmer och andra skyddande skorpor som minskar hastigheten på förruttnelse/nedbrytning (Martino, 2016). Därför kräver utvecklingen av effektiva långsiktigt hållbara bevarandestrategier för sten-, metall- och trämonument en grundlig förståelse av de viktigaste processerna som är involverade i denna process. Jämfört med naturliga processer (geologiska processer, skogsbränder, vulkanutbrott, växt- och bakteriereaktioner) resulterar mänskliga aktiviteter i utsläpp av stora volymer polycykliska aromatiska kolväten (PAH) och annat organiskt kol (OC) i ekosystem. Många PAH:er som används inom jordbruket (insekticider och bekämpningsmedel såsom DDT, atrazin, karbaryl, pentaklorofenol etc.), industrin (råolja, oljeslam/avfall, petroleumderiverad plast, PCB, mjukgörare, rengöringsmedel, desinfektionsmedel, gasningsmedel, dofter och konserveringsmedel), hygienprodukter (solskyddsmedel, desinfektionsmedel, insektsmedel och polycykliska mysker) och ammunition (sprängämnen såsom 2,4,6-TNT) är potentiella xenobiotika som kan påverka planetens hälsa (Srogi, 2007; Vamsee-Krishna och Phale, 2008; Petrie et al., 2015). Denna lista kan utökas till att omfatta petroleumderiverade föreningar (eldningsoljor, smörjmedel, asfaltener), bioplaster med hög molekylvikt och joniska vätskor (Amde et al., 2015). Tabell 1 listar olika aromatiska föroreningar och deras tillämpningar inom olika industrier. Under senare år har antropogena utsläpp av flyktiga organiska föreningar, såväl som koldioxid och andra växthusgaser, börjat öka (Dvorak et al., 2017). De antropogena effekterna överstiger dock avsevärt de naturliga. Dessutom fann vi att ett antal kemiska organiska föreningar (SOC) finns kvar i många miljöer och har identifierats som framväxande föroreningar med negativa effekter på biom (Figur 1). Miljömyndigheter som USA:s miljöskyddsmyndighet (USEPA) har inkluderat många av dessa föroreningar i sin prioriteringslista på grund av deras cytotoxiska, genotoxiska, mutagena och cancerframkallande egenskaper. Därför behövs strikta regler för avfallshantering/borttagning från förorenade ekosystem. Olika fysikaliska och kemiska behandlingsmetoder, såsom pyrolys, oxidativ värmebehandling, luftgenomluftning, deponering, förbränning etc., är ineffektiva och kostsamma och genererar frätande, giftiga och svårbehandlade biprodukter. Med ökande global miljömedvetenhet får mikroorganismer som kan bryta ner dessa föroreningar och deras derivat (såsom halogenerade, nitro-, alkyl- och/eller metyl-) allt större uppmärksamhet (Fennell et al., 2004; Haritash och Kaushik, 2009; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020; Schwanemann et al., 2020). Användningen av dessa inhemska kandidatmikroorganismer ensamma eller i blandade kulturer (kolonier) för att avlägsna aromatiska föroreningar har fördelar när det gäller miljösäkerhet, kostnad, effektivitet, ändamålsenlighet och hållbarhet. Forskare utforskar också integrationen av mikrobiella processer med elektrokemiska redoxmetoder, nämligen bioelektrokemiska system (BES), som en lovande teknik för behandling/borttagning av föroreningar (Huang et al., 2011). BES-tekniken har fått allt större uppmärksamhet på grund av sin höga effektivitet, låga kostnad, miljösäkerhet, rumstemperaturdrift, biokompatibla material och förmågan att återvinna värdefulla biprodukter (t.ex. elektricitet, bränsle och kemikalier) (Pant et al., 2012; Nazari et al., 2020). Tillkomsten av högkapacitets genomsekvensering och omikverktyg/metoder har gett en mängd ny information om genetisk reglering, proteomik och fluxomik av reaktionerna hos olika nedbrytande mikroorganismer. Genom att kombinera dessa verktyg med systembiologi har vi ytterligare förbättrat vår förståelse för urval och finjustering av målkataboliska vägar i mikroorganismer (dvs. metabolisk design) för att uppnå effektiv och ändamålsenlig biologisk nedbrytning. För att utforma effektiva bioremedieringsstrategier med hjälp av lämpliga kandidatmikroorganismer behöver vi förstå den biokemiska potentialen, metaboliska mångfalden, genetiska sammansättningen och ekologin (autoekologi/synekologi) hos mikroorganismer.
Figur 1. Källor och vägar för lågmolekylära PAH:er genom olika miljöer och olika faktorer som påverkar biota. Streckade linjer representerar interaktioner mellan ekosystemelement.
I denna översikt har vi försökt sammanfatta data om nedbrytning av enkla PAH:er såsom naftalen och substituerade naftalener av olika bakterieisolat, inklusive metaboliska vägar och mångfald, enzymer involverade i nedbrytningen, gensammansättning/innehåll och mångfald, cellulära svar och olika aspekter av bioremediering. Förståelse av de biokemiska och molekylära nivåerna kommer att bidra till att identifiera lämpliga värdstammar och deras vidare genteknik för effektiv bioremediering av sådana prioriterade föroreningar. Detta kommer att bidra till att utveckla strategier för att etablera platsspecifika bakteriekonsortier för effektiv bioremediering.
Närvaron av ett stort antal giftiga och farliga aromatiska föreningar (som uppfyller Huckels regel 4n + 2π-elektroner, n = 1, 2, 3, …) utgör ett allvarligt hot mot olika miljömedier såsom luft, jord, sediment samt yt- och grundvatten (Puglisi et al., 2007). Dessa föreningar har enkla bensenringar (monocykliska) eller flera bensenringar (polycykliska) arrangerade i linjär, vinkelform eller klusterform och uppvisar stabilitet (stabilitet/instabilitet) i miljön på grund av hög negativ resonansenergi och inerthet (inerthet), vilket kan förklaras av deras hydrofobicitet och reducerade tillstånd. När den aromatiska ringen ytterligare ersätts av metyl- (-CH3), karboxyl- (-COOH), hydroxyl- (-OH) eller sulfonat- (-HSO3) grupper blir den mer stabil, har en starkare affinitet för makromolekyler och är bioackumulerande i biologiska system (Seo et al., 2009; Phale et al., 2020). Vissa polycykliska aromatiska kolväten med låg molekylvikt (LMWAH), såsom naftalen och dess derivat [metylnaftalen, naftosyra, naftalensulfonat och 1-naftyl-N-metylkarbamat (karbaryl)], har inkluderats i listan över prioriterade organiska föroreningar av US Environmental Protection Agency som genotoxiska, mutagena och/eller cancerframkallande (Cerniglia, 1984). Utsläpp av denna klass av NM-PAH i miljön kan resultera i bioackumulering av dessa föreningar på alla nivåer i näringskedjan, vilket påverkar ekosystemens hälsa (Binkova et al., 2000; Srogi, 2007; Quinn et al., 2009).
Källorna till och spridningsvägarna för PAH till biota sker främst genom migration och interaktioner mellan olika ekosystemkomponenter såsom jord, grundvatten, ytvatten, grödor och atmosfären (Arey och Atkinson, 2003). Figur 1 visar interaktionerna och distributionen av olika lågmolekylära PAH i ekosystem och deras vägar till biota/mänsklig exponering. PAH deponeras på ytor som ett resultat av luftföroreningar och genom migration (drift) av fordonsutsläpp, industriella avgaser (kolförgasning, förbränning och koksproduktion) och deras deposition. Industriella aktiviteter såsom tillverkning av syntetiska textilier, färgämnen och målarfärger; träskydd; gummibearbetning; cementtillverkning; bekämpningsmedelsproduktion; och jordbrukstillämpningar är viktiga källor till PAH i terrestra och akvatiska system (Bamforth och Singleton, 2005; Wick et al., 2011). Studier har visat att jordar i förorts- och stadsområden, nära motorvägar och i storstäder är mer känsliga för polycykliska aromatiska kolväten (PAH) på grund av utsläpp från kraftverk, uppvärmning av bostäder, luft- och vägtrafikbelastning samt byggverksamhet (Suman et al., 2016). (2008) visade att PAH i jord nära vägar i New Orleans, Louisiana, USA var så höga som 7189 μg/kg, medan de i öppna ytor bara var 2404 μg/kg. På liknande sätt har PAH-nivåer så höga som 300 μg/kg rapporterats i områden nära kolförgasningsanläggningar i flera amerikanska städer (Kanaly och Harayama, 2000; Bamforth och Singleton, 2005). Jordar från olika indiska städer som Delhi (Sharma et al., 2008), Agra (Dubey et al., 2014), Mumbai (Kulkarni och Venkataraman, 2000) och Visakhapatnam (Kulkarni et al., 2014) har rapporterats innehålla höga koncentrationer av PAH. Aromatiska föreningar adsorberas lättare till jordpartiklar, organiskt material och lermineraler, och blir därmed viktiga kolsänkor i ekosystem (Srogi, 2007; Peng et al., 2008). De viktigaste källorna till PAH i akvatiska ekosystem är nederbörd (våt/torr nederbörd och vattenånga), avrinning från städer, avloppsvattenutsläpp, grundvattenpåfyllning etc. (Srogi, 2007). Det uppskattas att cirka 80 % av PAH i marina ekosystem härrör från nederbörd, sedimentation och avfallsutsläpp (Motelay-Massei et al., 2006; Srogi, 2007). Högre koncentrationer av PAH i ytvatten eller lakvatten från avfallsdeponier läcker så småningom ut i grundvattnet, vilket utgör ett stort hot mot folkhälsan eftersom mer än 70 % av befolkningen i Syd- och Sydostasien dricker grundvatten (Duttagupta et al., 2019). En nyligen genomförd studie av Duttagupta et al. (2020) av flod- (32) och grundvattenanalyser (235) från Västbengalen, Indien, fann att uppskattningsvis 53 % av stadsborna och 44 % av landsbygdsborna (totalt 20 miljoner invånare) kan exponeras för naftalen (4,9–10,6 μg/L) och dess derivat. Olika markanvändningsmönster och ökat grundvattenuttag anses vara de viktigaste faktorerna som styr den vertikala transporten (advektion) av lågmolekylära PAH i underjorden. Jordbruksavrinning, utsläpp av kommunalt och industriellt avloppsvatten samt utsläpp av fast avfall/sopor har visat sig påverkas av PAH i flodbassänger och sediment under jord. Atmosfärisk nederbörd förvärrar ytterligare PAH-föroreningar. Höga koncentrationer av PAH och deras alkylderivat (totalt 51) har rapporterats i floder/avrinningsområden världen över, såsom Fraser River, Louan River, Denso River, Missouri River, Anacostia River, Ebro River och Delaware River (Yunker et al., 2002; Motelay-Massei et al., 2006; Li et al., 2010; Amoako et al., 2011; Kim et al., 2018). I sedimenten i Gangesflodens avrinningsområde befanns naftalen och fenantren vara de mest betydande (detekterade i 70 % av proverna) (Duttagupta et al., 2019). Dessutom har studier visat att klorering av dricksvatten kan leda till bildandet av mer giftiga syresatta och klorerade PAH (Manoli och Samara, 1999). PAH ackumuleras i spannmål, frukt och grönsaker som ett resultat av upptag av växter från förorenade jordar, grundvatten och nederbörd (Fismes et al., 2002). Många vattenlevande organismer som fisk, musslor, vitlök och räkor är förorenade med PAH genom konsumtion av förorenad mat och havsvatten, samt genom vävnader och hud (Mackay och Fraser, 2000). Tillagnings-/bearbetningsmetoder som grillning, rostning, rökning, stekning, torkning, bakning och tillagning med kol kan också leda till betydande mängder PAH i livsmedel. Detta beror till stor del på valet av rökmaterial, innehållet av fenoliska/aromatiska kolväten, tillagningsprocedur, värmetyp, fukthalt, syretillförsel och förbränningstemperatur (Guillén et al., 2000; Gomes et al., 2013). Polycykliska aromatiska kolväten (PAH) har också detekterats i mjölk i varierande koncentrationer (0,75–2,1 mg/L) (Girelli et al., 2014). Ackumuleringen av dessa PAH i livsmedel beror också på livsmedlets fysikalisk-kemiska egenskaper, medan deras toxiska effekter är relaterade till fysiologiska funktioner, metabolisk aktivitet, absorption, distribution och kroppsdistribution (Mechini et al., 2011).
Toxiciteten och de skadliga effekterna av polycykliska aromatiska kolväten (PAH) har varit kända länge (Cherniglia, 1984). Lågmolekylära polycykliska aromatiska kolväten (LMW-PAH) (två till tre ringar) kan kovalent binda till olika makromolekyler såsom DNA, RNA och proteiner och är cancerframkallande (Santarelli et al., 2008). På grund av sin hydrofoba natur är de separerade av lipidmembran. Hos människor oxiderar cytokrom P450-monooxygenaser PAH till epoxider, av vilka vissa är mycket reaktiva (t.ex. baediolepoxid) och kan leda till omvandling av normala celler till maligna (Marston et al., 2001). Dessutom är omvandlingsprodukterna av PAH, såsom kinoner, fenoler, epoxider, dioler etc., mer toxiska än moderföreningarna. Vissa PAH och deras metaboliska intermediärer kan påverka hormoner och olika enzymer i metabolismen, och därigenom negativt påverka tillväxt, centrala nervsystemet, reproduktions- och immunsystemet (Swetha och Phale, 2005; Vamsee-Krishna et al., 2006; Oostingh et al., 2008). Kortvarig exponering för lågmolekylära PAH har rapporterats orsaka nedsatt lungfunktion och trombos hos astmatiker och öka risken för hud-, lung-, urinblåse- och mag-tarmcancer (Olsson et al., 2010; Diggs et al., 2011). Djurstudier har också visat att PAH-exponering kan ha negativa effekter på reproduktionsfunktion och utveckling och kan orsaka grå starr, njur- och leverskador samt gulsot. Olika PAH-biotransformationsprodukter såsom dioler, epoxider, kinoner och fria radikaler (katjoner) har visat sig bilda DNA-addukter. Stabila addukter har visat sig förändra DNA-replikationsmaskineriet, medan instabila addukter kan depurinera DNA (främst till adenin och ibland till guanin); båda kan generera fel som leder till mutationer (Schweigert et al. 2001). Dessutom kan kinoner (benso-/pan-) generera reaktiva syreradikaler (ROS), vilket orsakar dödlig skada på DNA och andra makromolekyler, och därigenom påverkar vävnadsfunktion/viabilitet (Ewa och Danuta 2017). Kronisk exponering för låga koncentrationer av pyren, bifenyl och naftalen har rapporterats orsaka cancer hos försöksdjur (Diggs et al. 2012). På grund av deras dödliga toxicitet är sanering/borttagning av dessa PAH från drabbade/kontaminerade platser en prioritet.
Olika fysikaliska och kemiska metoder har använts för att avlägsna PAH från förorenade platser/miljöer. Processer som förbränning, deklorering, UV-oxidation, fixering och lösningsmedelsextraktion har många nackdelar, inklusive bildandet av giftiga biprodukter, processkomplexitet, säkerhets- och regelproblem, låg effektivitet och höga kostnader. Mikrobiell biologisk nedbrytning (kallad bioremediering) är dock ett lovande alternativt tillvägagångssätt som involverar användning av mikroorganismer i form av rena kulturer eller kolonier. Jämfört med fysikaliska och kemiska metoder är denna process miljövänlig, icke-invasiv, kostnadseffektiv och hållbar. Bioremediering kan utföras på det drabbade området (in situ) eller på en speciellt förberedd plats (ex situ) och anses därför vara en mer hållbar saneringsmetod än traditionella fysikaliska och kemiska metoder (Juhasz och Naidu, 2000; Andreoni och Gianfreda, 2007; Megharaj et al., 2011; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020).
Att förstå de mikrobiella metaboliska stegen som är involverade i nedbrytningen av aromatiska föroreningar har enorma vetenskapliga och ekonomiska implikationer för ekologisk och miljömässig hållbarhet. Uppskattningsvis 2,1×1018 gram kol (C) lagras i sediment och organiska föreningar (dvs. olja, naturgas och kol, dvs. fossila bränslen) över hela världen, vilket ger ett betydande bidrag till den globala kolcykeln. Snabb industrialisering, utvinning av fossila bränslen och mänskliga aktiviteter utarmar dock dessa litosfäriska kolreservoarer och frigör uppskattningsvis 5,5×1015 g organiskt kol (som föroreningar) i atmosfären årligen (Gonzalez-Gaya et al., 2019). Det mesta av detta organiska kol kommer in i terrestra och marina ekosystem genom sedimentation, transport och avrinning. Dessutom förorenar nya syntetiska föroreningar som härrör från fossila bränslen, såsom plaster, mjukgörare och plaststabilisatorer (ftalater och deras isomerer), allvarligt marina, mark- och akvatiska ekosystem och deras biota, vilket förvärrar de globala klimatriskerna. Olika typer av mikroplaster, nanoplaster, plastfragment och deras giftiga monomerprodukter som härrör från polyetylentereftalat (PET) har ackumulerats i Stilla havet mellan Nordamerika och Sydostasien och bildat den "stora soporna i Stilla havet" (Stora Stilla havet), vilket skadar det marina livet (Newell et al., 2020). Vetenskapliga studier har visat att det inte är möjligt att avlägsna sådana föroreningar/avfall med några fysikaliska eller kemiska metoder. I detta sammanhang är de mest användbara mikroorganismerna de som kan oxidativt metabolisera föroreningar till koldioxid, kemisk energi och andra giftfria biprodukter som så småningom går in i andra näringscykelprocesser (H2, O2, N2, S2, P2, Fe2, etc.). Att förstå den mikrobiella ekofysiologin för aromatisk föroreningsmineralisering och dess miljökontroll är därför avgörande för att bedöma den mikrobiella kolcykeln, nettokolbudgeten och framtida klimatrisker. Med tanke på det akuta behovet av att avlägsna sådana föreningar från miljön har olika ekoindustrier inriktade på ren teknik uppstått. Alternativt anses värdeutnyttjande av industriavfall/avfallskemikalier som ackumuleras i ekosystem (dvs. avfall till rikedom-strategi) vara en av grundpelarna i den cirkulära ekonomin och målen för hållbar utveckling (Close et al., 2012). Därför är det av yttersta vikt att förstå de metaboliska, enzymatiska och genetiska aspekterna av dessa potentiella nedbrytningskandidater för effektivt avlägsnande och bioremediering av sådana aromatiska föroreningar.
Bland de många aromatiska föroreningarna ägnar vi särskild uppmärksamhet åt lågmolekylära PAH:er såsom naftalen och substituerade naftalener. Dessa föreningar är viktiga komponenter i petroleumderivat, textilfärgämnen, konsumentprodukter, bekämpningsmedel (malmedel och insektsmedel), mjukgörare och tanniner och är därför utbredda i många ekosystem (Preuss et al., 2003). Nyligen publicerade rapporter belyser ackumuleringen av naftalenkoncentrationer i akvifersediment, grundvatten och jordar i underjorden, vadoszoner och flodbäddar, vilket tyder på dess bioackumulering i miljön (Duttagupta et al., 2019, 2020). Tabell 2 sammanfattar de fysikalisk-kemiska egenskaperna, tillämpningarna och hälsoeffekterna av naftalen och dess derivat. Jämfört med andra högmolekylära PAH:er är naftalen och dess derivat mindre hydrofoba, mer vattenlösliga och vitt spridda i ekosystem, så de används ofta som modellsubstrat för att studera metabolism, genetik och metabolisk mångfald hos PAH:er. Ett stort antal mikroorganismer kan metabolisera naftalen och dess derivat, och omfattande information finns tillgänglig om deras metaboliska vägar, enzymer och reglerande egenskaper (Mallick et al., 2011; Phale et al., 2019, 2020). Dessutom är naftalen och dess derivat utsedda som prototypföreningar för bedömning av miljöföroreningar på grund av deras höga förekomst och biotillgänglighet. Den amerikanska miljöskyddsmyndigheten EPA uppskattar att genomsnittliga nivåer av naftalen är 5,19 μg per kubikmeter från cigarettrök, främst från ofullständig förbränning, och 7,8 till 46 μg från sidoströmsrök, medan exponering för kreosot och naftalen är 100 till 10 000 gånger högre (Preuss et al. 2003). Särskilt naftalen har visat sig ha art-, region- och könsspecifik andningstoxicitet och cancerframkallande egenskaper. Baserat på djurstudier har Internationella byrån för cancerforskning (IARC) klassificerat naftalen som ett "möjligt humant cancerframkallande ämne" (grupp 2B)1. Exponering för substituerade naftalener, främst genom inhalation eller parenteral (oral) administrering, orsakar lungvävnadsskador och ökar förekomsten av lungtumörer hos råttor och möss (National Toxicology Program 2). Akuta effekter inkluderar illamående, kräkningar, buksmärtor, diarré, huvudvärk, förvirring, riklig svettning, feber, takykardi etc. Å andra sidan har bredspektrum-karbamatinsekticiden karbaryl (1-naftyl-N-metylkarbamat) rapporterats vara giftig för vattenlevande ryggradslösa djur, amfibier, honungsbin och människor och har visat sig hämma acetylkolinesteras vilket orsakar förlamning (Smulders et al., 2003; Bulen och Distel, 2011). Därför är det avgörande att förstå mekanismerna för mikrobiell nedbrytning, genetisk reglering, enzymatiska och cellulära reaktioner för att utveckla bioremedieringsstrategier i förorenade miljöer.
Tabell 2. Detaljerad information om fysikalisk-kemiska egenskaper, användningsområden, identifieringsmetoder och associerade sjukdomar hos naftalen och dess derivat.
I förorenade nischer kan hydrofoba och lipofila aromatiska föroreningar orsaka en mängd olika cellulära effekter på miljömikrobiomet (samhället), såsom förändringar i membranfluiditet, membranpermeabilitet, svullnad av lipiddubbelskikt, störningar i energiöverföring (elektrontransportkedja/protondrivkraft) och aktivitet hos membranassocierade proteiner (Sikkema et al., 1995). Dessutom genererar vissa lösliga intermediärer såsom katekoler och kinoner reaktiva syreradikaler (ROS) och bildar addukter med DNA och proteiner (Penning et al., 1999). Således utövar förekomsten av sådana föreningar i ekosystem ett selektivt tryck på mikrobiella samhällen för att bli effektiva nedbrytare på olika fysiologiska nivåer, inklusive upptag/transport, intracellulär transformation, assimilering/utnyttjande och kompartmentalisering.
En sökning i Ribosomal Database Project-II (RDP-II) visade att totalt 926 bakteriearter isolerades från medier eller anrikningskulturer kontaminerade med naftalen eller dess derivat. Proteobacteria-gruppen hade det högsta antalet representanter (n = 755), följt av Firmicutes (52), Bacteroidetes (43), Actinobacteria (39), Tenericutes (10) och oklassificerade bakterier (8) (Figur 2). Representanter för γ-Proteobacteria (Pseudomonadales och Xanthomonadales) dominerade alla gramnegativa grupper med högt G+C-innehåll (54 %), medan Clostridiales och Bacillales (30 %) var grampositiva grupper med lågt G+C-innehåll. Pseudomonas (det högsta antalet, 338 arter) rapporterades kunna bryta ner naftalen och dess metylderivat i olika förorenade ekosystem (stenkolstjära, petroleum, råolja, slam, oljeutsläpp, avloppsvatten, organiskt avfall och deponier) samt i intakta ekosystem (jord, floder, sediment och grundvatten) (Figur 2). Dessutom visade anrikningsstudier och metagenomisk analys av några av dessa regioner att oodlade Legionella- och Clostridium-arter kan ha nedbrytningsförmåga, vilket indikerar behovet av att odla dessa bakterier för att studera nya vägar och metabolisk mångfald.
Fig. 2. Taxonomisk mångfald och ekologisk distribution av bakteriella representanter i miljöer förorenade med naftalen och naftalenderivat.
Bland de olika mikroorganismerna som bryter ner aromatiska kolväten är de flesta kapabla att bryta ner naftalen som enda kol- och energikälla. Händelseförloppet som är involverat i naftalenmetabolismen har beskrivits för Pseudomonas sp. (stammar: NCIB 9816-4, G7, AK-5, PMD-1 och CSV86), Pseudomonas stutzeri AN10, Pseudomonas fluorescens PC20 och andra stammar (ND6 och AS1) (Mahajan et al., 1994; Resnick et al., 1996; Annweiler et al., 2000; Basu et al., 2003; Dennis och Zylstra, 2004; Sota et al., 2006); Metabolismen initieras av ett multikomponentdioxygenas [naftalendioxygenas (NDO), ett ringhydroxylerande dioxygenas] som katalyserar oxidationen av en av de aromatiska ringarna i naftalen med användning av molekylärt syre som det andra substratet, vilket omvandlar naftalen till cis-naftalendiol (Figur 3). Cis-dihydrodiol omvandlas till 1,2-dihydroxinaftalen genom en dehydrogenas. Ett ringklyvande dioxygenas, 1,2-dihydroxinaftalendioxygenas (12DHNDO), omvandlar 1,2-dihydroxinaftalen till 2-hydroxikromen-2-karboxylsyra. Enzymatisk cis-trans-isomerisering producerar trans-o-hydroxibensylidenpyruvat, som klyvs av hydratasaldolas till salicylaldehyd och pyruvat. Den organiska syran pyruvat var den första C3-föreningen som härleddes från naftalens kolskelett och leddes in i den centrala kolvägen. Dessutom omvandlar NAD+-beroende salicylaldehyddehydrogenas salicylaldehyd till salicylsyra. Metabolismen i detta skede kallas den "övre vägen" för naftalennedbrytning. Denna väg är mycket vanlig i de flesta naftalennedbrytande bakterier. Det finns dock några få undantag; till exempel, i den termofila Bacillus hamburgii 2, initieras naftalennedbrytningen av naftalen-2,3-dioxygenas till bildar 2,3-dihydroxynaftalen (Annweiler et al., 2000).
Figur 3. Nedbrytningsvägar för naftalen, metylnaftalen, naftoesyra och karbaryl. Inringade siffror representerar enzymer som ansvarar för den sekventiella omvandlingen av naftalen och dess derivat till efterföljande produkter. 1 — naftalendioxygenas (NDO); 2, cis-dihydrodioldehydrogenas; 3, 1,2-dihydroxinaftalendioxygenas; 4, 2-hydroxikromen-2-karboxylsyraisomeras; 5, trans-O-hydroxibensylidenpyruvathydratas-aldolas; 6, salicylaldehyddehydrogenas; 7, salicylat-1-hydroxylas; 8, katekol-2,3-dioxygenas (C23DO); 9, 2-hydroximukonatsemialdehyddehydrogenas; 10, 2-oxopent-4-enoathydratas; 11, 4-hydroxi-2-oxopentanoat-aldolas; 12, acetaldehyddehydrogenas; 13, katekol-1,2-dioxygenas (C12DO); 14, mukonatcykloisomeras; 15, mukonolaktondelta-isomeras; 16, β-ketoadipatenolaktonhydrolas; 17, β-ketoadipat-succinyl-CoA-transferas; 18, β-ketoadipat-CoA-tiolas; 19, succinyl-CoA: acetyl-CoA-succinyltransferas; 20, salicylat-5-hydroxylas; 21-gentisat-1,2-dioxygenas (GDO); 22, maleylpyruvatisomeras; 23, fumarylpyruvathydrolas; 24, metylnaftalenhydroxylas (NDO); 25, hydroximetylnaftalendehydrogenas; 26, naftaldehyddehydrogenas; 27, 3-formylsalicylsyraoxidas; 28, hydroxiisoftalatdekarboxylas; 29, karbarylhydrolas (CH); 30, 1-naftol-2-hydroxylas.
Beroende på organismen och dess genetiska uppsättning metaboliseras den resulterande salicylsyran vidare antingen via katekolvägen med hjälp av salicylat-1-hydroxylas (S1H) eller via gentisatvägen med hjälp av salicylat-5-hydroxylas (S5H) (Figur 3). Eftersom salicylsyra är den huvudsakliga intermediären i naftalenmetabolismen (övre vägen), kallas stegen från salicylsyra till TCA-intermediären ofta för den nedre vägen, och generna är organiserade i en enda operon. Det är vanligt att se att generna i den övre vägens operon (nah) och den nedre vägens operon (sal) regleras av gemensamma reglerande faktorer; till exempel fungerar NahR och salicylsyra som inducerare, vilket gör att båda operonerna kan metabolisera naftalen fullständigt (Phale et al., 2019, 2020).
Dessutom klyvs katekol cykliskt till 2-hydroxymukonatsemialdehyd via metavägen av katekol 2,3-dioxygenas (C23DO) (Yen et al., 1988) och hydrolyseras vidare av 2-hydroxymukonatsemialdehydhydrolas för att bilda 2-hydroxipent-2,4-diensyra. 2-hydroxipent-2,4-dienoat omvandlas sedan till pyruvat och acetaldehyd av ett hydratas (2-oxopent-4-enoathydratas) och ett aldolas (4-hydroxi-2-oxopentanoat-aldolas) och går sedan in i den centrala kolvägen (Figur 3). Alternativt klyvs katekol cykliskt till cis,cis-mukonat via ortovägen av katekol 1,2-oxygenas (C12DO). Mukonatcykloisomeras, mukonolaktonisomeras och β-ketoadipat-nollaktonhydrolas omvandlar cis,cis-mukonat till 3-oxoadipat, som går in i den centrala kolvägen via succinyl-CoA och acetyl-CoA (Nozaki et al., 1968) (Figur 3).
I gentisatvägen (2,5-dihydroxibensoat) klyvs den aromatiska ringen av gentisat 1,2-dioxygenas (GDO) för att bilda maleylpyruvat. Denna produkt kan hydrolyseras direkt till pyruvat och malat, eller så kan den isomeriseras för att bilda fumarylpyruvat, som sedan kan hydrolyseras till pyruvat och fumarat (Larkin och Day, 1986). Valet av den alternativa vägen har observerats i både gramnegativa och grampositiva bakterier på biokemisk och genetisk nivå (Morawski et al., 1997; Whyte et al., 1997). Gramnegativa bakterier (Pseudomonas) föredrar att använda salicylsyra, som är en inducerare av naftalenmetabolism, och dekarboxylerar den till katekol med hjälp av salicylat 1-hydroxylas (Gibson och Subramanian, 1984). Å andra sidan, i grampositiva bakterier (Rhodococcus), omvandlar salicylat 5-hydroxylas salicylsyra till gentisinsyra, medan salicylsyra inte har någon induktiv effekt på transkriptionen av naftalengener (Grund et al., 1992) (Figur 3).
Det har rapporterats att arter som Pseudomonas CSV86, Oceanobacterium NCE312, Marinhomonas naphthotrophicus, Sphingomonas paucimobilis 2322, Vibrio cyclotrophus, Pseudomonas fluorescens LP6a, Pseudomonas och Mycobacterium kan bryta ner monometylnaftalen eller dimetylnaftalen (Dean-Raymond och Bartha, 1975; Cane och Williams, 1982; Mahajan et al., 1994; Dutta et al., 1998; Hedlund et al., 1999). Bland dem har nedbrytningsvägarna för 1-metylnaftalen och 2-metylnaftalen för Pseudomonas sp. CSV86 studerats tydligt på biokemisk och enzymatisk nivå (Mahajan et al., 1994). 1-metylnaftalen metaboliseras via två vägar. Först hydroxyleras den aromatiska ringen (den osubstituerade ringen i metylnaftalen) för att bilda cis-1,2-dihydroxi-1,2-dihydro-8-metylnaftalen, som oxideras vidare till metylsalicylat och metylkatekol, och sedan går in i den centrala kolvägen efter ringklyvning (Figur 3). Denna väg kallas "kolkällavägen". I den andra "avgiftningsvägen" kan metylgruppen hydroxyleras av NDO för att bilda 1-hydroximetylnaftalen, som oxideras vidare till 1-naftosyra och utsöndras i odlingsmediet som en återvändsgrändsprodukt. Studier har visat att stammen CSV86 inte kan växa på 1- och 2-naftosyra som enda kol- och energikälla, vilket bekräftar dess avgiftningsväg (Mahajan et al., 1994; Basu et al., 2003). I 2-metylnaftalen genomgår metylgruppen hydroxylering av hydroxylas för att bilda 2-hydroximetylnaftalen. Dessutom genomgår den osubstituerade ringen i naftalenringen ringhydroxylering för att bilda en dihydrodiol, som oxideras till 4-hydroximetylkatekol i en serie enzymkatalyserade reaktioner och går in i den centrala kolvägen via meta-ringklyvningsvägen. På liknande sätt rapporterades det att S. paucimobilis 2322 använder NDO för att hydroxylera 2-metylnaftalen, som ytterligare oxideras för att bilda metylsalicylat och metylkatekol (Dutta et al., 1998).
Naftoesyror (substituerade/osubstituerade) är biprodukter från avgiftning/biotransformation som bildas under nedbrytningen av metylnaftalen, fenantren och antracen och frigörs i det använda odlingsmediet. Det har rapporterats att jordisolatet Stenotrophomonas maltophilia CSV89 kan metabolisera 1-naftoesyra som kolkälla (Phale et al., 1995). Metabolismen börjar med dihydroxylering av den aromatiska ringen för att bilda 1,2-dihydroxi-8-karboxinaftalen. Den resulterande diolen oxideras till katekol via 2-hydroxi-3-karboxibensylidenpyruvat, 3-formylsalicylsyra, 2-hydroxiisoftalsyra och salicylsyra och går in i den centrala kolvägen via meta-ringklyvningsvägen (Figur 3).
Karbaryl är ett bekämpningsmedel som innehåller naftylkarbamat. Sedan den gröna revolutionen i Indien på 1970-talet har användningen av kemiska gödningsmedel och bekämpningsmedel lett till en ökning av utsläpp av polycykliska aromatiska kolväten (PAH) från jordbrukskällor utanför punktform (Pingali, 2012; Duttagupta et al., 2020). Uppskattningsvis 55 % (85 722 000 hektar) av den totala odlingsmarken i Indien behandlas med kemiska bekämpningsmedel. Under de senaste fem åren (2015–2020) har den indiska jordbrukssektorn använt i genomsnitt 55 000 till 60 000 ton bekämpningsmedel årligen (Department of Cooperatives and Farmers Welfare, Ministry of Agriculture, Government of India, augusti 2020). I de norra och centrala Gangeslätterna (delstaterna med högst befolkning och befolkningstäthet) är användningen av bekämpningsmedel på grödor utbredd, med insekticider som dominerar. Karbaryl (1-naftyl-N-metylkarbamat) är ett bredspektrum, måttligt till mycket giftigt karbamatinsekticid som används i indiskt jordbruk i en genomsnittlig mängd på 100–110 ton. Det säljs vanligtvis under handelsnamnet Sevin och används för att bekämpa insekter (bladlöss, brandmyror, loppor, kvalster, spindlar och många andra utomhusskadedjur) som påverkar en mängd olika grödor (majs, sojabönor, bomull, frukt och grönsaker). Vissa mikroorganismer som Pseudomonas (NCIB 12042, 12043, C4, C5, C6, C7, Pseudomonas putida XWY-1), Rhodococcus (NCIB 12038), Sphingobacterium spp. (CF06), Burkholderia (C3), Micrococcus och Arthrobacter kan också användas för att bekämpa andra skadedjur. Det har rapporterats att RC100 kan bryta ner karbaryl (Larkin och Day, 1986; Chapalamadugu och Chaudhry, 1991; Hayatsu et al., 1999; Swetha och Phale, 2005; Trivedi et al., 2017). Nedbrytningsvägen för karbaryl har studerats omfattande på biokemisk, enzymatisk och genetisk nivå i jordisolat av Pseudomonas sp. Stammarna C4, C5 och C6 (Swetha och Phale, 2005; Trivedi et al., 2016) (Fig. 3). Den metaboliska vägen börjar med hydrolys av esterbindningen med karbarylhydrolas (CH4) för att bilda 1-naftol, metylamin och koldioxid. 1-naftol omvandlas sedan till 1,2-dihydroxinaftalen av 1-naftolhydroxylas (1-NH), som vidare metaboliseras via den centrala kolvägen via salicylat och gentisat. Vissa karbarylnedbrytande bakterier har rapporterats metabolisera den till salicylsyra via klyvning av katekol-orto-ringen (Larkin och Day, 1986; Chapalamadugu och Chaudhry, 1991). Det är värt att notera att naftalennedbrytande bakterier primärt metaboliserar salicylsyra via katekol, medan karbarylnedbrytande bakterier föredrar att metabolisera salicylsyra via gentisatvägen.
Naftalensulfonsyra/disulfonsyra och naftylaminsulfonsyraderivat kan användas som mellanprodukter vid framställning av azofärgämnen, vätmedel, dispergeringsmedel etc. Även om dessa föreningar har låg toxicitet för människor, har cytotoxicitetsbedömningar visat att de är dödliga för fisk, daphnier och alger (Greim et al., 1994). Representanter för släktet Pseudomonas (stammarna A3, C22) har rapporterats initiera metabolism genom dubbel hydroxylering av den aromatiska ringen som innehåller sulfonsyragruppen för att bilda en dihydrodiol, som vidare omvandlas till 1,2-dihydroxinaftalen genom spontan klyvning av sulfitgruppen (Brilon et al., 1981). Den resulterande 1,2-dihydroxinaftalenen kataboliseras via den klassiska naftalenvägen, dvs. katekol- eller gentisatvägen (Figur 4). Det har visats att aminonaftalensulfonsyra och hydroxinaftalensulfonsyra kan brytas ner fullständigt av blandade bakteriekonsortier med komplementära kataboliska vägar (Nortemann et al., 1986). Det har visats att en medlem i konsortiet avsvavlar aminonaftalensulfonsyra eller hydroxinaftalensulfonsyra genom 1,2-dioxigenering, medan aminosalicylat eller hydroxysalicylat frisätts i odlingsmediet som en återvändsgrändsmetabolit och därefter tas upp av andra medlemmar i konsortiet. Naftalendisulfonsyra är relativt polär men svårnedbrytbar och kan därför metaboliseras via olika vägar. Den första avsvavlingen sker under regioselektiv dihydroxylering av den aromatiska ringen och sulfonsyragruppen; Den andra avsvavlingen sker under hydroxylering av 5-sulfosalicylsyra med salicylsyra-5-hydroxylas för att bilda gentisinsyra, som går in i den centrala kolvägen (Brilon et al., 1981) (Figur 4). De enzymer som ansvarar för naftalennedbrytning är också ansvariga för naftalensulfonatmetabolismen (Brilon et al., 1981; Keck et al., 2006).
Figur 4. Metaboliska vägar för nedbrytning av naftalensulfonat. Siffrorna inuti cirklarna representerar de enzymer som ansvarar för naftylsulfonatmetabolismen, liknande/identiska med de enzymer som beskrivs i FIG. 3.
Lågmolekylära PAH (LMW-PAH) är reducerbara, hydrofoba och svårlösliga, och därför inte känsliga för naturlig nedbrytning/nedbrytning. Aeroba mikroorganismer kan dock oxidera dem genom att absorbera molekylärt syre (O2). Dessa enzymer tillhör huvudsakligen klassen oxidoreduktaser och kan utföra olika reaktioner såsom aromatisk ringhydroxylering (mono- eller dihydroxylering), dehydrogenering och aromatisk ringklyvning. Produkterna som erhålls från dessa reaktioner har ett högre oxidationstillstånd och metaboliseras lättare genom den centrala kolvägen (Phale et al., 2020). Enzymerna i nedbrytningsvägen har rapporterats vara inducerbara. Aktiviteten hos dessa enzymer är mycket låg eller försumbar när celler odlas på enkla kolkällor såsom glukos eller organiska syror. Tabell 3 sammanfattar de olika enzymerna (oxygenaser, hydrolaser, dehydrogenaser, oxidaser, etc.) som är involverade i metabolismen av naftalen och dess derivat.
Tabell 3. Biokemiska egenskaper hos enzymer som ansvarar för nedbrytningen av naftalen och dess derivat.
Radioisotopstudier (18O2) har visat att införlivandet av molekylärt O2 i aromatiska ringar av oxygenaser är det viktigaste steget för att aktivera ytterligare biologisk nedbrytning av en förening (Hayaishi et al., 1955; Mason et al., 1955). Införlivandet av en syreatom (O) från molekylärt syre (O2) i substratet initieras av antingen endogena eller exogena monooxygenaser (även kallade hydroxylaser). En annan syreatom reduceras till vatten. Exogena monooxygenaser reducerar flavin med NADH eller NADPH, medan flavin i endomonooxygenaser reduceras av substratet. Hydroxyleringspositionen resulterar i mångfald i produktbildningen. Till exempel hydroxylerar salicylat-1-hydroxylas salicylsyra vid C1-positionen och bildar katekol. Å andra sidan hydroxylerar multikomponentsalicylat-5-hydroxylasen (innehållande reduktas-, ferredoxin- och oxygenas-subenheter) salicylsyra vid C5-positionen och bildar gentisinsyra (Yamamoto et al., 1965).
Dioxygenaser inkorporerar två O2-atomer i substratet. Beroende på vilka produkter som bildas delas de in i ringhydroxylerande dioxygenaser och ringklyvande dioxygenaser. Ringhydroxylerande dioxygenaser omvandlar aromatiska substrat till cis-dihydrodioler (t.ex. naftalen) och är utbredda bland bakterier. Hittills har det visats att organismer som innehåller ringhydroxylerande dioxygenaser kan växa på olika aromatiska kolkällor, och dessa enzymer klassificeras som NDO (naftalen), toluendioxygenas (TDO, toluen) och bifenyldioxygenas (BPDO, bifenyl). Både NDO och BPDO kan katalysera dubbeloxidation och sidokedjehydroxylering av olika polycykliska aromatiska kolväten (toluen, nitrotoluen, xylen, etylbensen, naftalen, bifenyl, fluoren, indol, metylnaftalen, naftalensulfonat, fenantren, antracen, acetofenon, etc.) (Boyd och Sheldrake, 1998; Phale et al., 2020). NDO är ett flerkomponentsystem bestående av ett oxidoreduktas, ett ferredoxin och en aktiv oxygenaskomponent (Gibson och Subramanian, 1984; Resnick et al., 1996). Den katalytiska enheten i NDO består av en stor α-subenhet och en liten β-subenhet arrangerade i en α3β3-konfiguration. NDO tillhör en stor familj av oxygenaser och dess α-subenhet innehåller ett Rieske-ställe [2Fe-2S] och ett mononukleärt icke-hemjärn, vilket bestämmer substratspecificiteten hos NDO (Parales et al., 1998). Vanligtvis överförs två elektroner från reduktionen av pyridinnukleotiden i en katalytisk cykel till Fe(II)-jonen i det aktiva sätet via ett reduktas, ett ferredoxin och ett Rieske-ställe. De reducerande ekvivalenterna aktiverar molekylärt syre, vilket är en förutsättning för substratdihydroxylering (Ferraro et al., 2005). Hittills har endast ett fåtal NDO renats och karakteriserats i detalj från olika stammar och den genetiska kontrollen av de vägar som är involverade i naftalennedbrytning har studerats i detalj (Resnick et al., 1996; Parales et al., 1998; Karlsson et al., 2003). Ringklyvande dioxygenaser (endo- eller orto-ringklyvande enzymer och exodiol- eller meta-ringklyvande enzymer) verkar på hydroxylerade aromatiska föreningar. Till exempel är det orto-ringklyvande dioxygenaset katekol-1,2-dioxygenas, medan det meta-ringklyvande dioxygenaset är katekol-2,3-dioxygenas (Kojima et al., 1961; Nozaki et al., 1968). Förutom olika oxygenaser finns det också olika dehydrogenaser som ansvarar för dehydrogeneringen av aromatiska dihydrodioler, alkoholer och aldehyder och använder NAD+/NADP+ som elektronacceptorer, vilka är några av de viktiga enzymer som är involverade i metabolismen (Gibson och Subramanian, 1984; Shaw och Harayama, 1990; Fahle et al., 2020).
Enzymer som hydrolaser (esteraser, amidaser) är en andra viktig klass av enzymer som använder vatten för att klyva kovalenta bindningar och uppvisar bred substratspecificitet. Karbarylhydrolas och andra hydrolaser anses vara komponenter i periplasman (transmembranet) hos medlemmar av gramnegativa bakterier (Kamini et al., 2018). Karbaryl har både en amid- och en esterbindning; därför kan den hydrolyseras av antingen esteras eller amidas för att bilda 1-naftol. Karbaryl i Rhizobium rhizobium-stammen AC10023 och Arthrobacter-stammen RC100 har rapporterats fungera som ett esteras respektive amidas. Karbaryl i Arthrobacter-stammen RC100 fungerar också som ett amidas. RC100 har visat sig hydrolysera fyra insekticider av N-metylkarbamatklassen, såsom karbaryl, metomyl, mefenaminsyra och XMC (Hayaatsu et al., 2001). Det rapporterades att CH i Pseudomonas sp. C5pp kan verka på karbaryl (100 % aktivitet) och 1-naftylacetat (36 % aktivitet), men inte på 1-naftylacetamid, vilket indikerar att det är ett esteras (Trivedi et al., 2016).
Biokemiska studier, enzymregleringsmönster och genetisk analys har visat att naftalennedbrytningsgenerna består av två inducerbara regleringsenheter eller "operoner": nah ("uppströmsvägen", som omvandlar naftalen till salicylsyra) och sal ("nedströmsvägen", som omvandlar salicylsyra till den centrala kolvägen via katekol). Salicylsyra och dess analoger kan fungera som inducerare (Shamsuzzaman och Barnsley, 1974). I närvaro av glukos eller organiska syror undertrycks operonet. Figur 5 visar den fullständiga genetiska organisationen av naftalennedbrytning (i operonform). Flera namngivna varianter/former av nah-genen (ndo/pah/dox) har beskrivits och visat sig ha hög sekvenshomologi (90 %) bland alla Pseudomonas-arter (Abbasian et al., 2016). Generna för naftalens uppströmsväg var generellt arrangerade i en konsensusordning som visas i figur 5A. En annan gen, nahQ, har också rapporterats vara involverad i naftalenmetabolism och var vanligtvis belägen mellan nahC och nahE, men dess faktiska funktion återstår att klargöra. På liknande sätt hittades nahY-genen, ansvarig för naftalenkänslig kemotaxi, vid den distala änden av nah-operonen hos vissa medlemmar. I Ralstonia sp. fann man att U2-genen som kodar för glutation S-transferas (gsh) var belägen mellan nahAa och nahAb men påverkade inte naftalenutnyttjandeegenskaperna (Zylstra et al., 1997).
Figur 5. Genetisk organisation och mångfald observerad under naftalennedbrytning bland bakteriearter; (A) Övre naftalenvägen, metabolism av naftalen till salicylsyra; (B) Nedre naftalenvägen, salicylsyra via katekol till den centrala kolvägen; (C) salicylsyra via gentisat till den centrala kolvägen.
Den "nedre signalvägen" (sal-operonen) består vanligtvis av nahGTHINLMOKJ och omvandlar salicylat till pyruvat och acetaldehyd via katekolmetariseringsvägen. nahG-genen (som kodar för salicylathydroxylas) befanns vara konserverad vid den proximala änden av operonen (Fig. 5B). Jämfört med andra naftalennedbrytande stammar är nah- och sal-operonerna tandem och mycket nära besläktade (cirka 7,5 kb) i P. putida CSV86. I vissa gramnegativa bakterier, såsom Ralstonia sp. U2, Polaramonas naphthalenivorans CJ2 och P. putida AK5, metaboliseras naftalen som en central kolmetabolit via gentisatvägen (i form av sgp/nag-operonen). Genkassetten representeras vanligtvis i formen nagAaGHAbAcAdBFCQEDJI, där nagR (som kodar för en LysR-typ regulator) är belägen i den övre änden (figur 5C).
Karbaryl går in i den centrala kolcykeln via metabolismen av 1-naftol, 1,2-dihydroxinaftalen, salicylsyra och gentisinsyra (Figur 3). Baserat på genetiska och metaboliska studier har det föreslagits att dela in denna väg i "uppströms" (omvandling av karbaryl till salicylsyra), "mitten" (omvandling av salicylsyra till gentisinsyra) och "nedströms" (omvandling av gentisinsyra till intermediärer i den centrala kolcykeln) (Singh et al., 2013). Genomisk analys av C5pp (supercontig A, 76,3 kb) visade att mcbACBDEF-genen är involverad i omvandlingen av karbaryl till salicylsyra, följt av mcbIJKL i omvandlingen av salicylsyra till gentisinsyra och mcbOQP i omvandlingen av gentisinsyra till centrala kolintermediärer (fumarat och pyruvat, Trivedi et al., 2016) (Figur 6).
Det har rapporterats att enzymer involverade i nedbrytningen av aromatiska kolväten (inklusive naftalen och salicylsyra) kan induceras av motsvarande föreningar och hämmas av enkla kolkällor såsom glukos eller organiska syror (Shingler, 2003; Phale et al., 2019, 2020). Bland de olika metaboliska vägarna för naftalen och dess derivat har de reglerande egenskaperna hos naftalen och karbaryl studerats i viss utsträckning. För naftalen regleras gener i både uppströms- och nedströmsvägarna av NahR, en transaktiv positiv regulator av LysR-typ. Den krävs för induktion av nah-genen av salicylsyra och dess efterföljande högnivåuttryck (Yen och Gunsalus, 1982). Dessutom har studier visat att integrativ värdfaktor (IHF) och XylR (sigma 54-beroende transkriptionsregulator) också är avgörande för transkriptionsaktiveringen av gener i naftalenmetabolismen (Ramos et al., 1997). Studier har visat att enzymer i katekolens meta-ringöppningsväg, nämligen katekol 2,3-dioxygenas, induceras i närvaro av naftalen och/eller salicylsyra (Basu et al., 2006). Studier har visat att enzymer i katekolens orto-ringöppningsväg, nämligen katekol 1,2-dioxygenas, induceras i närvaro av bensoesyra och cis,cis-mukonat (Parsek et al., 1994; Tover et al., 2001).
I stammen C5pp kodar fem gener, mcbG, mcbH, mcbN, mcbR och mcbS, för regulatorer som tillhör LysR/TetR-familjen av transkriptionsregulatorer som ansvarar för att kontrollera karbarylnedbrytning. Den homologa genen mcbG visade sig vara närmast besläktad med LysR-typregulatorn PhnS (58 % aminosyraidentitet) involverad i fenantrenmetabolism i Burkholderia RP00725 (Trivedi et al., 2016). McbH-genen visade sig vara involverad i den mellanliggande vägen (omvandling av salicylsyra till gentisinsyra) och tillhör LysR-typtranskriptionsregulatorn NagR/DntR/NahR i Pseudomonas och Burkholderia. Medlemmar i denna familj rapporterades känna igen salicylsyra som en specifik effektormolekyl för induktion av nedbrytningsgener. Å andra sidan identifierades tre gener, mcbN, mcbR och mcbS, som tillhör transkriptionsregulatorer av LysR- och TetR-typ, i nedströmsvägen (metaboliter i gentisat-centrala kolvägar).
Hos prokaryoter är horisontella genöverföringsprocesser (förvärv, utbyte eller överföring) via plasmider, transposoner, profager, genomiska öar och integrativa konjugativa element (ICE) viktiga orsaker till plasticitet i bakteriella genom, vilket leder till att specifika funktioner/egenskaper ökar eller minskar. Det gör att bakterier snabbt kan anpassa sig till olika miljöförhållanden, vilket ger potentiella adaptiva metaboliska fördelar för värden, såsom nedbrytning av aromatiska föreningar. Metaboliska förändringar uppnås ofta genom finjustering av nedbrytningsoperoner, deras regleringsmekanismer och enzymspecificiteter, vilket underlättar nedbrytningen av ett bredare spektrum av aromatiska föreningar (Nojiri et al., 2004; Phale et al., 2019, 2020). Genkassetterna för naftalennedbrytning har visat sig vara belägna på en mängd olika mobila element såsom plasmider (konjugativa och icke-konjugativa), transposoner, genom, ICE och kombinationer av olika bakteriearter (Figur 5). I Pseudomonas G7 transkriberas nah- och sal-operonerna i plasmiden NAH7 i samma orientering och är en del av ett defekt transposon som kräver transposaset Tn4653 för mobilisering (Sota et al., 2006). I Pseudomonas-stammen NCIB9816-4 hittades genen på den konjugativa plasmiden pDTG1 som två operoner (ungefär 15 kb ifrån varandra) som transkriberades i motsatta riktningar (Dennis och Zylstra, 2004). I Pseudomonas putida-stammen AK5 kodar den icke-konjugativa plasmiden pAK5 för enzymet som ansvarar för naftalennedbrytning via gentisatvägen (Izmalkova et al., 2013). I Pseudomonas-stammen PMD-1 är nah-operonen belägen på kromosomen, medan sal-operonen är belägen på den konjugativa plasmiden pMWD-1 (Zuniga et al., 1981). I Pseudomonas stutzeri AN10 är dock alla naftalennedbrytningsgener (nah- och sal-operoner) belägna på kromosomen och rekryteras förmodligen genom transposition, rekombination och omorganisering (Bosch et al., 2000). I Pseudomonas sp. CSV86 är nah- och sal-operonerna belägna i genomet i form av ICE (ICECSV86). Strukturen skyddas av tRNAGly följt av direkta upprepningar som indikerar rekombinations-/fästningsställen (attR och attL) och ett fagliknande integras beläget i båda ändar av tRNAGly, och är således strukturellt likt ICEclc-elementet (ICEclcB13 i Pseudomonas knackmusii för klorokatekolnedbrytning). Det har rapporterats att gener på ICE kan överföras genom konjugering med en extremt låg överföringsfrekvens (10-8), varigenom nedbrytningsegenskaper överförs till mottagaren (Basu och Phale, 2008; Phale et al., 2019).
De flesta gener som ansvarar för karbarylnedbrytning finns på plasmider. Arthrobacter sp. RC100 innehåller tre plasmider (pRC1, pRC2 och pRC300) varav två konjugativa plasmider, pRC1 och pRC2, kodar för de enzymer som omvandlar karbaryl till gentisat. Å andra sidan finns de enzymer som är involverade i omvandlingen av gentisat till de centrala kolmetaboliterna på kromosomen (Hayaatsu et al., 1999). Bakterier av släktet Rhizobium. Stammen AC100, som används för omvandling av karbaryl till 1-naftol, innehåller plasmiden pAC200, som bär cehA-genen som kodar för CH som en del av Tnceh-transposonet omgivet av insertionselementliknande sekvenser (istA och istB) (Hashimoto et al., 2002). I Sphingomonas-stammen CF06 tros karbarylnedbrytningsgenen finnas i fem plasmider: pCF01, pCF02, pCF03, pCF04 och pCF05. DNA-homologin hos dessa plasmider är hög, vilket indikerar förekomsten av en gendupliceringshändelse (Feng et al., 1997). I en karbarylnedbrytande symbiont bestående av två Pseudomonas-arter innehåller stam 50581 en konjugativ plasmid pCD1 (50 kb) som kodar för mcd-karbarylhydrolasgenen, medan den konjugativa plasmiden i stam 50552 kodar för ett 1-naftolnedbrytande enzym (Chapalamadugu och Chaudhry, 1991). I Achromobacter-stammen WM111 är mcd-furadanhydrolasgenen belägen på en 100 kb plasmid (pPDL11). Denna gen har visat sig finnas på olika plasmider (100, 105, 115 eller 124 kb) i olika bakterier från olika geografiska regioner (Parekh et al., 1995). I Pseudomonas sp. C5pp finns alla gener som är ansvariga för karbarylnedbrytning i ett genom som sträcker sig över 76,3 kb sekvens (Trivedi et al., 2016). Genomanalys (6,15 Mb) avslöjade närvaron av 42 MGE och 36 GEI, varav 17 MGE var belägna i supercontig A (76,3 kb) med ett genomsnittligt asymmetriskt G+C-innehåll (54–60 mol%), vilket tyder på möjliga horisontella genöverföringshändelser (Trivedi et al., 2016). P. putida XWY-1 uppvisar ett liknande arrangemang av karbarylnedbrytande gener, men dessa gener är belägna på en plasmid (Zhu et al., 2019).
Förutom metabolisk effektivitet på biokemisk och genomisk nivå uppvisar mikroorganismer även andra egenskaper eller reaktioner såsom kemotaxi, modifiering av cellytor, kompartmentalisering, preferensiellt utnyttjande, produktion av biosurfaktanter etc., vilket hjälper dem att mer effektivt metabolisera aromatiska föroreningar i förorenade miljöer (Figur 7).
Figur 7. Olika cellulära responsstrategier hos ideala aromatiska kolväte-nedbrytande bakterier för effektiv biologisk nedbrytning av främmande förorenande föreningar.
Kemotaktiska reaktioner anses vara faktorer som förstärker nedbrytningen av organiska föroreningar i heterogent förorenade ekosystem. (2002) visade att kemotaxi av Pseudomonas sp. G7 till naftalen ökade nedbrytningshastigheten för naftalen i akvatiska system. Vildtypstammen G7 bröt ned naftalen mycket snabbare än en kemotaxi-bristfällig mutantstam. NahY-proteinet (538 aminosyror med membrantopologi) befanns vara kotranskriberat med metakleavage-väggenerna på NAH7-plasmiden, och liksom kemotaxitransduktorer verkar detta protein fungera som en kemoreceptor för naftalennedbrytning (Grimm och Harwood 1997). En annan studie av Hansel et al. (2009) visade att proteinet är kemotaktiskt, men dess nedbrytningshastighet är hög. (2011) visade ett kemotaktiskt svar hos Pseudomonas (P. putida) på gasformig naftalen, där gasfasdiffusion resulterade i ett stadigt flöde av naftalen till cellerna, vilket kontrollerade cellernas kemotaktiska svar. Forskarna utnyttjade detta kemotaktiska beteende för att konstruera mikrober som skulle öka nedbrytningshastigheten. Studier har visat att kemosensoriska vägar också reglerar andra cellulära funktioner såsom celldelning, cellcykelreglering och biofilmbildning, vilket bidrar till att kontrollera nedbrytningshastigheten. Att utnyttja denna egenskap (kemotaxi) för effektiv nedbrytning hindras dock av flera flaskhalsar. De största hindren är: (a) olika paraloga receptorer känner igen samma föreningar/ligander; (b) förekomsten av alternativa receptorer, dvs. energetisk tropism; (c) signifikanta sekvensskillnader i de sensoriska domänerna hos samma receptorfamilj; och (d) brist på information om de viktigaste bakteriella sensorproteinerna (Ortega et al., 2017; Martin-Mora et al., 2018). Ibland producerar biologisk nedbrytning av aromatiska kolväten flera metaboliter/intermediärer, vilka kan vara kemotaktiska för en grupp bakterier men frånstötande för andra, vilket ytterligare komplicerar processen. För att identifiera interaktionerna mellan ligander (aromatiska kolväten) och kemiska receptorer konstruerade vi hybridsensorproteiner (PcaY, McfR och NahY) genom att fusionera sensor- och signaldomänerna hos Pseudomonas putida och Escherichia coli, vilka riktar sig mot receptorerna för aromatiska syror, TCA-intermediärer respektive naftalen (Luu et al., 2019).
Under påverkan av naftalen och andra polycykliska aromatiska kolväten (PAH) genomgår bakteriemembranets struktur och mikroorganismernas integritet betydande förändringar. Studier har visat att naftalen stör acylkedjans interaktion genom hydrofoba interaktioner, vilket ökar membranets svullnad och fluiditet (Sikkema et al., 1995). För att motverka denna skadliga effekt reglerar bakterier membranets fluiditet genom att ändra förhållandet och fettsyrasammansättningen mellan iso/anteiso-grenade fettsyror och isomerisera cis-omättade fettsyror till motsvarande trans-isomerer (Heipieper och de Bont, 1994). I Pseudomonas stutzeri som odlats med naftalenbehandling ökade förhållandet mellan mättade och omättade fettsyror från 1,1 till 2,1, medan detta förhållande i Pseudomonas JS150 ökade från 7,5 till 12,0 (Mrozik et al., 2004). När Achromobacter KAs 3–5-celler odlades på naftalen uppvisade de cellaggregation runt naftalenkristaller och en minskning av cellytans laddning (från -22,5 till -2,5 mV) åtföljd av cytoplasmisk kondensation och vakuolisering, vilket indikerar förändringar i cellstruktur och cellytegenskaper (Mohapatra et al., 2019). Även om cellulära/ytförändringar är direkt förknippade med bättre upptag av aromatiska föroreningar, har relevanta biotekniska strategier inte optimerats noggrant. Manipulering av cellform har sällan använts för att optimera biologiska processer (Volke och Nikel, 2018). Deletion av gener som påverkar celldelning orsakar förändringar i cellmorfologin. Deletion av gener som påverkar celldelning orsakar förändringar i cellmorfologin. Hos Bacillus subtilis har cellseptumproteinet SepF visat sig vara involverat i septumbildning och krävs för efterföljande steg i celldelningen, men det är inte en essentiell gen. Deletion av gener som kodar för peptidglykanhydrolaser i Bacillus subtilis resulterade i cellförlängning, ökad specifik tillväxthastighet och förbättrad enzymproduktionskapacitet (Cui et al., 2018).
Kompartmentalisering av karbarylnedbrytningsvägen har föreslagits för att uppnå effektiv nedbrytning av Pseudomonas-stammarna C5pp och C7 (Kamini et al., 2018). Det föreslås att karbaryl transporteras in i det periplasmatiska utrymmet genom det yttre membranseptumet och/eller genom diffuserbara poriner. CH₄ är ett periplasmatiskt enzym som katalyserar hydrolysen av karbaryl till 1-naftol, vilket är mer stabilt, mer hydrofobt och mer toxiskt. CH₄ är lokaliserat i periplasman och har en låg affinitet för karbaryl, vilket kontrollerar bildandet av 1-naftol, varigenom dess ackumulering i celler förhindras och dess toxicitet för celler minskas (Kamini et al., 2018). Den resulterande 1-naftolen transporteras in i cytoplasman över det inre membranet genom partitionering och/eller diffusion, och hydroxyleras sedan till 1,2-dihydroxinaftalen av det högaffinitetsenzymet 1NH₃ för vidare metabolism i den centrala kolvägen.
Även om mikroorganismer har den genetiska och metaboliska förmågan att bryta ner xenobiotiska kolkällor, är den hierarkiska strukturen för deras utnyttjande (dvs. föredragen användning av enkla framför komplexa kolkällor) ett stort hinder för biologisk nedbrytning. Närvaron och utnyttjandet av enkla kolkällor nedreglerar gener som kodar för enzymer som bryter ner komplexa/icke-föredragna kolkällor såsom PAH. Ett välstuderat exempel är att när glukos och laktos sammatas med Escherichia coli, utnyttjas glukos mer effektivt än laktos (Jacob och Monod, 1965). Pseudomonas har rapporterats bryta ner en mängd olika PAH och xenobiotiska föreningar som kolkällor. Hierarkin för utnyttjande av kolkällor i Pseudomonas är organiska syror > glukos > aromatiska föreningar (Hylemon och Phibbs, 1972; Collier et al., 1996). Det finns dock ett undantag. Intressant nog är Pseudomonas sp. CSV86 uppvisar en unik hierarkisk struktur som företrädesvis använder aromatiska kolväten (bensoesyra, naftalen, etc.) snarare än glukos och ko-metaboliserar aromatiska kolväten med organiska syror (Basu et al., 2006). I denna bakterie är generna för nedbrytning och transport av aromatiska kolväten inte nedreglerade ens i närvaro av en andra kolkälla såsom glukos eller organiska syror. Vid odling i glukos- och aromatiska kolvätemedium observerades att generna för glukostransport och metabolism var nedreglerade, aromatiska kolväten användes i den första logaritmiska fasen och glukos användes i den andra logaritmiska fasen (Basu et al., 2006; Choudhary et al., 2017). Å andra sidan påverkade inte närvaron av organiska syror uttrycket av aromatiska kolvätemetabolism, så denna bakterie förväntas vara en kandidatstam för biologiska nedbrytningsstudier (Phale et al., 2020).
Det är välkänt att kolvätebiotransformation kan orsaka oxidativ stress och uppreglering av antioxidantenzymer i mikroorganismer. Ineffektiv naftalennedbrytning både i stationära celler och i närvaro av toxiska föreningar leder till bildandet av reaktiva syreradikaler (ROS) (Kang et al. 2006). Eftersom naftalennedbrytande enzymer innehåller järn-svavelkluster, kommer järnet i hem- och järn-svavelproteiner att oxideras under oxidativ stress, vilket leder till proteininaktivering. Ferredoxin-NADP+ reduktas (Fpr), tillsammans med superoxiddismutas (SOD), medierar den reversibla redoxreaktionen mellan NADP+/NADPH och två molekyler av ferredoxin eller flavodoxin, varigenom ROS elimineras och järn-svavelcentret återställs under oxidativ stress (Li et al. 2006). Det har rapporterats att både Fpr och SodA (SOD) i Pseudomonas kan induceras av oxidativ stress, och ökad SOD- och katalasaktivitet observerades i fyra Pseudomonas-stammar (O1, W1, As1 och G1) under tillväxt under förhållanden med tillsatt naftalen (Kang et al., 2006). Studier har visat att tillsats av antioxidanter såsom askorbinsyra eller järn(II) (Fe2+) kan öka tillväxthastigheten för naftalen. När Rhodococcus erythropolis växte i naftalenmedium ökade transkriptionen av oxidativ stressrelaterade cytokrom P450-gener inklusive sodA (Fe/Mn superoxiddismutas), sodC (Cu/Zn superoxiddismutas) och recA (Sazykin et al., 2019). Jämförande kvantitativ proteomisk analys av Pseudomonas-celler odlade i naftalen visade att uppreglering av olika proteiner associerade med oxidativ stressrespons är en strategi för att hantera stress (Herbst et al., 2013).
Mikroorganismer har rapporterats producera biosurfaktanter under inverkan av hydrofoba kolkällor. Dessa tensider är amfifila ytaktiva föreningar som kan bilda aggregat vid gränsytorna mellan olja och vatten eller luft och vatten. Detta främjar pseudo-solubilisering och underlättar adsorptionen av aromatiska kolväten, vilket resulterar i effektiv biologisk nedbrytning (Rahman et al., 2002). På grund av dessa egenskaper används biosurfaktanter i stor utsträckning inom olika industrier. Tillsats av kemiska tensider eller biosurfaktanter till bakteriekulturer kan öka effektiviteten och hastigheten för kolvätenedbrytningen. Bland de biosurfaktanterna har ramnolipider producerade av Pseudomonas aeruginosa studerats och karakteriserats ingående (Hisatsuka et al., 1971; Rahman et al., 2002). Dessutom inkluderar andra typer av biosurfaktanter lipopeptider (muciner från Pseudomonas fluorescens), emulgeringsmedlet 378 (från Pseudomonas fluorescens) (Rosenberg och Ron, 1999), trehalosdisackaridlipider från Rhodococcus (Ramdahl, 1985), lichenin från Bacillus (Saraswathy och Hallberg, 2002) och surfaktant från Bacillus subtilis (Siegmund och Wagner, 1991) och Bacillus amyloliquefaciens (Zhi et al., 2017). Dessa potenta surfaktanter har visat sig minska ytspänningen från 72 dyn/cm till mindre än 30 dyn/cm, vilket möjliggör bättre kolväteabsorption. Det har rapporterats att Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Burkholderia och andra bakteriearter kan producera olika rhamnolipid- och glykolipidbaserade biosurfaktanter när de odlas i naftalen- och metylnaftalenmedier (Kanga et al., 1997; Puntus et al., 2005). Pseudomonas maltophilia CSV89 kan producera extracellulärt biosurfaktant Biosur-Pm när det odlas på aromatiska föreningar såsom naftoesyra (Phale et al., 1995). Kinetiken för Biosur-Pm-bildning visade att dess syntes är en tillväxt- och pH-beroende process. Det visade sig att mängden Biosur-Pm som producerades av celler vid neutralt pH var högre än vid pH 8,5. Celler som odlats vid pH 8,5 var mer hydrofoba och hade högre affinitet för aromatiska och alifatiska föreningar än celler som odlats vid pH 7,0. I Rhodococcus spp. N6, högre kol-kväve-förhållande (C:N) och järnbegränsning är optimala förhållanden för produktion av extracellulära biosurfaktanter (Mutalik et al., 2008). Försök har gjorts för att förbättra biosyntesen av biosurfaktanter (surfaktiner) genom att optimera stammar och fermentering. Titern av surfaktant i odlingsmediet är dock låg (1,0 g/L), vilket utgör en utmaning för storskalig produktion (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Därför har gentekniska metoder använts för att förbättra dess biosyntes. Dess tekniska modifiering är dock svår på grund av operonets stora storlek (∼25 kb) och komplex biosyntetisk reglering av kvorumavkänningssystemet (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Ett antal gentekniska modifieringar har utförts i Bacillus-bakterier, huvudsakligen inriktade på att öka surfaktinproduktionen genom att ersätta promotorn (srfA-operonen), överuttrycka surfaktinexportproteinet YerP och de regulatoriska faktorerna ComX och PhrC (Jiao et al., 2017). Dessa gentekniska metoder har dock endast uppnått en eller ett fåtal genetiska modifieringar och har ännu inte nått kommersiell produktion. Därför är ytterligare studier av kunskapsbaserade optimeringsmetoder nödvändiga.
Studier av PAH-nedbrytning utförs huvudsakligen under standardiserade laboratorieförhållanden. På förorenade platser eller i förorenade miljöer har dock många abiotiska och biotiska faktorer (temperatur, pH, syre, näringstillgänglighet, substratbiotillgänglighet, andra xenobiotika, slutprodukthämning etc.) visat sig förändra och påverka mikroorganismers nedbrytningsförmåga.
Temperaturen har en betydande effekt på PAH-nedbrytningen. När temperaturen ökar minskar koncentrationen av löst syre, vilket påverkar metabolismen hos aeroba mikroorganismer, eftersom de kräver molekylärt syre som ett av substraten för oxygenaser som utför hydroxylering eller ringklyvningsreaktioner. Det noteras ofta att förhöjd temperatur omvandlar de ursprungliga PAH:erna till mer giftiga föreningar, vilket hämmar biologisk nedbrytning (Muller et al., 1998).
Det har noterats att många PAH-förorenade platser har extrema pH-värden, såsom sura gruvdräneringsförorenade platser (pH 1–4) och naturgas-/kolförgasningsplatser förorenade med alkaliskt lakvatten (pH 8–12). Dessa förhållanden kan allvarligt påverka den biologiska nedbrytningsprocessen. Därför rekommenderas det, innan mikroorganismer används för bioremediering, att justera pH-värdet genom att tillsätta lämpliga kemikalier (med måttlig till mycket låg oxidations-reduktionspotential) såsom ammoniumsulfat eller ammoniumnitrat för alkaliska jordar eller kalkning med kalciumkarbonat eller magnesiumkarbonat för sura platser (Bowlen et al. 1995; Gupta och Sar 2020).
Syretillförsel till det drabbade området är den hastighetsbegränsande faktorn för PAH-biologisk nedbrytning. På grund av miljöns redoxförhållanden kräver in situ-biologisk sanering vanligtvis syretillförsel från externa källor (jordbearbetning, luftinblåsning och kemisk tillsats) (Pardieck et al., 1992). Odenkranz et al. (1996) visade att tillsats av magnesiumperoxid (en syrefrisättande förening) till en förorenad akvifer effektivt kunde bioremediera BTEX-föreningar. En annan studie undersökte in situ-nedbrytningen av fenol och BTEX i en förorenad akvifer genom att injicera natriumnitrat och konstruera extraktionsbrunnar för att uppnå effektiv bioremediering (Bewley och Webb, 2001).