Nuvarande†Nuvarande adress: OX11 0DE, Storbritannien, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, Storbritannien, Diamond Light Source Co., Ltd., Electronic Biological Imaging Center.
Reaktionscentrets ljusinsamlande komplex 1 (RC-LH1) är den centrala fotosyntetiska komponenten hos lila fototrofa bakterier. Vi introducerade två kryoelektronmikroskopistrukturer av RC-LH1-komplexet från Rhodopseudomonas palustris. 2,65 Å-upplösningsstrukturen för RC-LH114-W-komplexet består av 14 subenhets-LH1-slingor som omger RC, vilket avbryts av protein W, medan komplexet utan protein-W är helt RC-komposition omgivet av RC. Sluten LH1-slinga med 16 subenheter. Jämförelsen av dessa strukturer ger insikter i dynamiken hos kinon i RC-LH1-komplexet, inklusive tidigare obestämda konformationsförändringar vid bindning av kinon vid RC QB-stället, samt placeringen av hjälpkinonbindningsställen, vilket hjälper till att passera dem till RC. Den unika strukturen hos W-proteinet förhindrar stängning av LH1-slingan, vilket skapar en kanal för att accelerera kinon/kinolonutbytet.
Den energi som fotosyntesen ger kan upprätthålla nästan allt liv på jorden, och den har stor potential för solbioteknik. Samtidigt som de främjar global fotosyntes uppvisar lila fototrofa bakterier också olika energisätt och metaboliska förmågor. De kan undvika fotosyntes och växa som heterotrofa bakterier i mörkret, kan fixera kväve och koldioxid, producera väte och bryta ner aromatiska föreningar (1-3). För att tillhandahålla energi för dessa processer måste ljus snabbt och effektivt omvandlas till kemisk energi. Denna process börjar när det ljusfångande antennkomplexet absorberar ljus och överför den fångade energin till reaktionscentret (RC), varigenom laddningsseparation startar (4–7). Den grundläggande enheten för fotosyntes i lila fototrofa bakterier består av typ 2 RC, omgiven av ljusupptagningskomplex 1 (LH1), vilket bildar RC-LH1-kärnkomplexet. LH1 bildas av en uppsättning böjda αβ-heterodimerer, som var och en binder två bakteriella klorofyll (BChl) a-molekyler och en eller två karotenoider (8-12). Den enklaste LH1-antennen består av 16 eller 17 αβ-heterodimerer som omger RC (9-13) i en sluten slinga, men i andra kärnkomplex avbryter transmembranpeptider kontinuiteten hos den omgivande LH1, vilket främjar kinol/kinondiffusionen mellan RC och cytokrom bc1-komplexet (11, 13-15). Den lila fototrofa växten Rhodopseudomonas (Rps.) är en modellorganism som kan förstå den energi- och elektronöverföring som stöder fotosyntes. Den första kristallstrukturen för Rps. Modellen för palustris RC-LH1-komplexet är RC, omgiven av 15 heterodimera LH1-slingor, vilka avbryts av ett okänt protein som kallas "Protein W" (14). Protein-W identifierades senare som RPA4402, vilket är ett okarakteriserat 10,5 kDa-protein med tre förutsagda transmembranspiraler (TMH) (16). Vi föreslår att byta namn på rpa4402-genen som kodar för protein W till pufW för att vara konsekvent med den nomenklatur som används för gener som kodar för RC-L, M (pufL, pufM) och LH1α, β (pufA, pufB) subenheter. Intressant nog finns protein-W endast i cirka 10 % av RC-LH1, vilket avslöjar att Rps. palustris producerar två olika RC-LH1-komplex. Här rapporterar vi de högupplösta kryo-EM (kryo-EM) strukturerna hos två kärnkomplex, ett med protein W och 14 αβ heterodimerer, det andra utan protein W och en sluten 16 heterodimer LH1-loop. Vår struktur representerar en stegvis förändring i förståelsen av RC-LH1-komplexet hos Rps. palustris, eftersom vi har analyserat den homogena populationen av varje variant och har tillräcklig upplösning för att tydligt tilldela varje peptid och bundna pigment och relaterade lipider och kinoner. Jämförelsen av dessa strukturer visar att de tre TMH-proteinerna-W som hittills inte har hittats i något annat RC-LH1-komplex genererar en kinonkanal för att accelerera kinon/kinolon-utbytet. Ett antal konserverade lipid- och kinonbindningsställen har identifierats, och vi har avslöjat en ny konformationsförändring efter kombinationen av kinon och RC, vilken kan vara lämplig för fotosystem II (PSII) RC hos syresatta fototrofa organismer. Våra resultat ger nya insikter i kinetiken för kinon/kinolon-bindning och -utbyte i RC-LH1-kärnkomplexet hos purpurfärgade fototrofa bakterier.
För att underlätta en detaljerad studie av de två komplexen som finns i Rps. palustris isolerar vi varje RC-LH1 med biokemiska metoder. Det protein W-bristfälliga komplexet (nedan kallat ΔpufW) renades från stammen som saknar pufW-genen (16), och endast ett RC-LH1-komplex kan produceras. Det protein W-innehållande komplexet produceras av en stam. Protein W från denna stam modifieras med en 10x His-märkning vid dess C-terminal, så att det protein W-innehållande komplexet effektivt kan kombineras med det mesta saknade protein W genom immobilisering av metall. Komplexet separeras effektivt (16) med hjälp av affinitetskromatografi (IMAC).
Som visas i figur 1 innehåller båda komplexen en RC med tre underenheter (RC-L, RC-M och RC-H) omgiven av en LH1-antenn. 2,80-A-strukturen hos komplexet som saknar protein-W uppvisar 16 αβ-heterodimerer, som bildar en sluten LH1-slinga som helt omger RC, nedan kallat RC-LH116-komplexet. 2,65 Å-strukturen hos det protein-W-innehållande komplexet har en 14-heterodimer LH1 avbruten av protein-W, nedan kallad RC-LH114-W.
(A och B) Ytrepresentation av föreningen. (C och D) Bindna pigment uttryckta i stavar. (E och F) Komplexen som observeras från den cytoplasmiska ytan har peptiderna och LH1-subenheterna representerade i teckningarna och är numrerade medurs från protein-W-gapet [i överensstämmelse med Rba-numrering. sphaeroides-komplex (13)]. För LH1-α är färgen på proteinsubenheten gul; för LH1-β är färgen på proteinsubenheten blå; för protein-W är proteinet rött; för RC-H är det cyan; för RC-L är det orange; för RC-M, magenta. Kofaktorer representeras av stavar, grönt representerar BChl- och BPha-molekyler, lila representerar karotenoider och gult representerar UQ10-molekyler. (G och H) Förstorad vy av protein-W-gapet i den ekvivalenta regionen av RC-LH114-W-komplexet (G) och RC-LH116-komplexet (H). Kofaktorer visas i form av utfyllnad av rymd, kelerat kinon visas i blått. Protein-W-gapet är markerat med en blå streckad linje i (G), och de små hålen där kinon/kinolol diffunderar på LH116-ringen är markerade med en svart streckad linje i (H).
Figur 1 (A och B) visar RC omgiven av öppna eller slutna grupper av LH1αβ-heterodimerer, som var och en binder två BChl och en karotenoid (Figur 1, C och D). Tidigare studier har visat att Rps är LH1-komplexet. I den biosyntetiska vägen för spirulinaxantin innehåller dessa arter blandade populationer av karotenoider (17). Spiropyrroxantin är dock den dominerande karotenoiden och dess densitet är tillfredsställande. Därför valde vi att modellera spiroxantin vid alla LH1-bindningsställen. Alfa- och beta-polypeptiderna är enskilda TMH med korta yttre membranregioner (Figur 1, A, B, E och F). Även om densiteten på 17 rester vid C-terminalen inte observerades, klyvdes alfa-polypeptiden från Met1 till Ala46 i båda komplexen. β-polypeptiden reducerades från Gly4 till Tyr52 i RC-LH116 och från Ser5 till Tyr52 i RC-LH114-W. Ingen densitet av 3 eller 4 N-terminala eller 13 C-terminala rester observerades (Figur S1). Masspektrometrianalys av det blandade RC-LH1-komplexet framställt från vildtypstammen visade att den saknade regionen var resultatet av heterolog klyvning av dessa peptider (Figur S1 och S2). N-terminal formylering av α-Met1 observerades också (f). Analysen visade att α-peptiden består av resterna fMet1 till Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, och β-peptiden består av resterna Ser2 till Ala53, vilket överensstämmer väl med lågtemperatur-EM-densitetskartan.
Koordinationen av α-His29 och β-His36 gör att BChl:erna är ansikte mot ansikte; varje αβ-heterodimer sammanfogas med sina grannar för att bilda en öppen slinga (RC-LH114-W) eller en sluten slinga (RC-LH116) runt RC-Den excitonkopplade pigmentmatrisen (Figur 1, C och D). Jämfört med 877 nm-bandet för RC-LH114-W är absorptionsrödförskjutningen vid 880 nm för RC-LH116 3 nm (Figur 2A). Det cirkulära dikroismspektrumet är dock nästan detsamma (Figur 2B), vilket indikerar att även om det finns en tydlig skillnad mellan öppna och slutna slingor, är den lokala miljön för BChl:erna mycket likartad. Absorptionsrödförskjutningen kan vara resultatet av minskad termisk rörelse och ökad stabilitet på den slutna slingan (18, 19), förändringen i pigmentkoppling orsakad av den slutna slingan (20, 21), eller en kombination av dessa två effekter (11).
(A) Ultraviolett/synligt/nära-infrarött absorptionsspektrum, vars toppar är markerade med motsvarande pigment och normaliserade till BPh-toppen vid 775 nm. (B) Cirkulärt dikroismspektrum normaliserat till BChl-absorbans vid 805 nm. (C och D) Valda ΔA-spektra från de tidsupplösta absorptionsspektra för RC-LH114-W-komplexet (C) och RC-LH116-komplexet (D). För bättre jämförbarhet är alla spektra normaliserade till ∆A för −A vid 0,2 ps. (E) Hastigheten för cytokrom c2-oxidation efter bestrålning i närvaro av olika koncentrationer av UQ2 (se figur S8 för rådata). (F) I celler odlade under låg-, medel- eller högintensivt ljus (10, 30 respektive 300 μMm-2 s-1), protein W- och RC-L-subenheterna i det renade komplexet och det separerade membranförhållandet. Bestäm proteinnivån med SDS-polyakrylamidgelelektrofores och immunanalys (se figur S9 för rådata). Bestäm förhållandet i förhållande till det renade RC-LH114-W-komplexet. Det stökiometriska förhållandet mellan RC-L och protein-W i komplexet är 1:1.
BChl-molekylerna vid position 1 i den deformerade αβ14-slingan i RC-LH114-W (Figur 1, A, C och E) är närmare RC-primärdonatorn (P) med 6,8 ​​Å än motsvarande BChl-molekyler i RC-LH116 (Figur 1, B, D och F, samt Figur S3); emellertid visar den transienta absorptionskinetiken för de två komplexen att för RC-LH114-W och RC-LH116 är excitationsenergiöverföringstidskonstanterna från LH1 till RC 40 ±4 och 44 ±3 ps (Figur 2, C och D, Figur S4 och Tabell S2). Det finns inte heller någon signifikant skillnad i elektronisk överföring inom RC (Figur S5 och relaterad kompletterande text). Vi misstänker att den nära överensstämmelsen mellan energiöverföringstiden mellan LH1 och RC-P beror på det liknande avståndet, vinkeln och den potentiella energin hos de flesta BChl-molekyler i de två LH1-slingorna. Det verkar som att det inte går snabbare att utforska LH1-energimönstret för att nå det minsta avståndet än direkt energiöverföring från suboptimala platser till RC. Den öppna LH1-slingan i RC-LH114-W kan också genomgå obetydlig termisk rörelse under låga temperaturförhållanden för strukturell analys, och det finns en längre αβ14-ringkonformation vid rumstemperatur från pigmenteringsavståndet för βBChls vid positionen för RC 1.
RC-LH116-komplexet innehåller 32 BChl och 16 karotenoider, och dess övergripande arrangemang är detsamma som det som erhållits från Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970-stam (PDB ID 7C9R) (12) och grönalger (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Efter uppriktning observerades endast små avvikelser i positionerna för αβ-heterodimerer, särskilt 1-5, 15 och 16 (Figur S6). Närvaron av protein-W har en betydande inverkan på strukturen hos LH1. Dess tre TMH är sammankopplade med korta slingor, med N-terminalen på lumensidan av komplexet och C-terminalen på den cytoplasmatiska sidan (Figur 1A och 3, A till D). Protein-W är till stor del hydrofobt (Figur 3B), och TMH2 och TMH3 interagerar med LH1αβ-14 för att bilda en transmembranyta (Figur 3, B och E till G). Gränssnittet består huvudsakligen av Phe-, Leu- och Val-rester i transmembranregionen. Dessa rester är staplade med hydrofoba aminosyror och αβ-14-pigment. Vissa polära rester bidrar också till interaktionen, inklusive vätebindningen mellan W-Thr68 och β-Trp42 på ytan av den komplexa kaviteten (Figur 3, F och G). På cytoplasmans yta ligger Gln34 intill ketogruppen av αβ-14-karotenoider. Dessutom upplöstes n-dodecyl-β-d-maltosid (β-DDM)-molekylen, och dess hydrofoba svans sträckte sig till gränssnittet mellan protein-W och αβ-14, och lipidsvansen kan finnas i kroppen. Vi noterade också att de C-terminala upplösningsregionerna hos protein W och RCH ligger mycket nära varandra, men inte inom ramen för specifika interaktioner (Figur 1, A och E). Det kan dock finnas interaktioner i de olösta C-terminala aminosyrorna hos dessa två proteiner, vilket kan ge en mekanism för rekryteringen av protein-W under sammansättningen av RC-LH114-W-komplexet.
(A) Protein-W, som vetter mot gränssnittet med LH1αβ14 i tecknad form, har en stavformad sidokedja (röd), som visas i en del av det elektrostatiska potentialdiagrammet (transparent grå yta med en konturnivå på 0,13). (B) Protein-W representeras av en hydrofob färgad yta. Polära och laddade områden visas i cyan, hydrofoba områden visas i vitt och starkt hydrofoba områden visas i orange. (C och D) Protein-W representeras i tecknad form, dess orientering är densamma som i (A) (C) och roterad 180° (D). Beroende på positionen i sekvensen antar de urskiljbara resterna ett regnbågsfärgschema, där N-terminalen är blå och C-terminalen är röd. (E) Protein-W i samma vy som i (A), och resterna vid gränssnittet mellan protein-W:LH1 representeras av stavar med vidhäftade markeringar. (F) Protein-W är roterat 90° i förhållande till (E) och LH1αβ14 i seriefiguren, och i förhållande till gränssnittsresterna i stapelrepresentationen. De överhängande resterna från beta-polypeptiden är märkta. Kofaktorn visas som en stapel som matchar färgen i figur 1, den nedbrutna β-DDM visas i grått och syret visas i rött. (G) Vyn i (F) är roterad 180°, med de framträdande resterna av den märkta alfa-polypeptiden.
Protein-W ersätter en αβ-heterodimer (den 15:e i figur 1F), vilket förhindrar loop-slutning och lutar de tre första αβ-heterodimererna. Det observerades att den maximala lutningsvinkeln för den första αβ-1-heterodimeren i förhållande till filmnormalen var 25° till 29° (figur 1, A och E), vilket bildades av 2° till 8° lutningen av αβ-1 i RC A sharp contrast-LH116 (figur 1, B och F). Den andra och tredje heterodimererna lutar vid 12° till 22° respektive 5° till 10°. På grund av det steriska hindret hos RC inkluderar lutningen av αβ-1 inte det andra paret av αβ (vilket motsvarar den 16:e αβ i figur 1F), vilket bildar ett tydligt gap i LH1-ringen (figur 1, A och E). På grund av avsaknaden av två αβ-heterodimerer, åtföljt av förlusten av fyra BChl och två karotenoider, binder ingen av karotenoiderna till den vridna αβ-1-subenheten, vilket resulterar i en LH114-W-ring innehållande 13 vegetariska karotenoider och 28 BChl. De lokala upplösningsuppskattningarna för de två komplexen i regionerna αβ1 till 7 är lägre än för resten av LH1-slingan, vilket kan återspegla den inneboende plasticiteten hos LH1-subenheten intill RC QB-stället (Figur 4).
Bilderna på RC-LH114-W (A och B) och RC-LH116 (C och D) visas från samma toppvy/sidovy (A och B) (A och C) och kavitetsyta som i figur 1 (B och D). De färgade tangenterna visas till höger.
Det enda andra karakteristiska kärnkomplexet med ett stökiometriskt förhållande på 1:14 är Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX-dimeren (13). Protein W och PufX har dock ingen uppenbar homologi och har en betydande inverkan på deras respektive LH1-strukturer. PufX är en enda TMH med en N-terminal cytoplasmisk domän som interagerar med den cytoplasmatiska sidan av RC-H-subenheten (13) vid en position som motsvarar Rps. palustris LH116αβ-16. PufX skapar en kanal för kinon/kinolon-utbytet mellan RC-LH1 och cytokrom bcl-komplexet och finns i alla Rba. sphaeroides-kärnkomplex (13). Även om monomer-monomer-gränssnittet finns i Rba. Sphaeroides RC-LH1-PufX-dimeren är belägen vid bindningspositionen för protein W i RC-LH114-W, och gapet som induceras av PufX och protein-W är vid en ekvivalent position (Figur S7A). Gapet i RC-LH114-W är också i linje med den hypotetiska kinonkanalen (8) hos Pseudomonas rosea LH1, som bildas av peptider som inte är relaterade till protein W eller PufX (Figur S7B). Dessutom är kinonkanalen i Blc. Den smaragdgröna LH1 som bildas genom att exkludera en γ-subenhet (7) är belägen i en liknande position (Figur S7C). Även om den medieras av olika proteiner, verkar uppkomsten av dessa kinon/kinololkanaler i en gemensam position i RC-LH1-komplexet vara ett exempel på konvergent evolution, vilket indikerar att gapet som skapas av protein W kan fungera som en kinonkanal.
Gapet i LH114-W-slingan möjliggör bildandet av en kontinuerlig membranregion mellan det inre utrymmet i RC-LH114-W-komplexet och bulkmembranet (Figur 1G), snarare än att de två domänerna förbinds genom en proteinpor som i proteiner. RC-LH116-komplexet liknar ett slutet Tch.-nålliknande komplex (22) (Figur 1H). Eftersom diffusionen av kinon genom membranet är snabbare än diffusionen genom den smala proteinkanalen, kan den öppna LH114-W-slingan möjliggöra snabbare RC-omsättning än den slutna LH116-slingan, och diffusionen av kinon in i RC kan vara mer begränsad. För att testa om protein W påverkar omvandlingen av kinoner genom RC, utförde vi en cytokromoxidationsanalys på en viss koncentration av ubikinon 2 (UQ2) (en analog till naturlig UQ10 med en kortare isopren-svans) (Figur 2E). Även om närvaron av kelerat kinon hindrar den noggranna bestämningen av den skenbara Michaelis-konstanten (RC-LH114-W och RC-LH116 är lämpliga för 0,2 ± 0,1 μM respektive 0,5 ± 0,2 μM), är den maximala hastigheten för RC-LH114-W (4,6 ± 0,2 e-RC-1 s-1) 28 ± 5 % större än RC-LH116 (3,6 ± 0,1 e-RC-1 s-1).
Vi uppskattade initialt att protein-W finns i cirka 10 % av kärnkomplexet (16); här är beläggningsgraden för tillväxtceller med svagt ljus, medelljus och starkt ljus 15 ± 0,6 %, 11 ± 1 % respektive 0,9 ± 0,5 % (Figur 2F). Kvantitativ jämförelse av masspektrometri visade att tillsatsen av histidinmärkning inte minskade den relativa förekomsten av protein-W jämfört med vildtypstammar (P = 0,59), så dessa nivåer är inte en artefakt av modifierat protein-W (Figur S10). Denna låga beläggning av protein-W i RC-LH1-komplexet kan dock tillåta att vissa RC:er byter frekvens i en accelererad takt, vilket mildrar det långsammare kinon/kinolonutbytet i RC-LH116-komplexet. Vi noterade att den höga ljusbeläggningsgraden inte överensstämmer med de senaste transkriptomikdata, vilket indikerar att pufW-genuttrycket ökar under starkt ljus (Figur S11) (23). Skillnaden mellan pufW-transkription och protein-W-inkorporering i RC-LH1-komplexet är förvirrande och kan återspegla proteinets komplexa reglering.
I RC-LH114-W allokeras 6 kardiolipin (CDL), 7 fosfatidylkolin (POPC), 1 fosfatidylglycerol (POPG) och 29 β-DDM-molekyler och modelleras i den: 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG och 12 βDDM. RC-LH116 (Figur 5, A och B). I dessa två strukturer är CDL nästan beläget på den cytoplasmatiska sidan av komplexet, medan POPC, POPG och β-DDM mestadels är belägna på den luminala sidan. Två lipid- och detergentmolekyler isolerades i αβ-1 till αβ-6-regionen av RC-LH114-W-komplexet (Figur 5A), och fem isolerades i den ekvivalenta regionen av RC-LH116 (Figur 5B). Fler lipider hittades på andra sidan av komplexet, främst CDL, ackumulerade mellan RC och αβ-7 till αβ-13 (Figur 5, A och B). Andra strukturellt upplösta lipider och detergenter är belägna utanför LH1-ringen, och väl upplösta acylkedjor sträcker sig mellan LH1-subenheter, preliminärt betecknade som β-DDM i RC-LH114-W, och definierade som β-DDM i RC En blandning av β-DDM och POPC-LH116. De liknande positionerna för kelaterande lipider och detergenter i vår struktur indikerar att de är fysiologiskt relevanta bindningsställen (Figur S12A). Positionerna för ekvivalenta molekyler i Tch har också god konsistens. Gentle och Trv. Stam 970 RC-LH1 (Figur S12, B till E) (9, 12) och vätebindningsresterna i lipidhuvudgruppen uppvisade ganska god konservering i sekvensinriktningen (Figur S13), vilket indikerar att konserverade CDL som binder till RC (24), dessa platser kan vara konserverade i RC-LH1-komplexet.
(A och B) RC-LH114-W (A) och RC-LH116 (B) peptider representeras av tecknade figurer, och pigmenten representeras av stavar, med hjälp av färgschemat i figur 1. Lipider visas i rött och detergenter visas i grått. UQ bundet till RC QA- och QB-ställen är gult, medan isolerat UQ är blått. (C och D) Samma vyer som (A) och (B), med lipider utelämnade. (E till G) Förstorad vy av Q1(E), Q2(F) och Q3(G) från RC-LH116, med sidokedjor som påverkar varandra. Vätebindningarna visas som svarta streckade linjer.
I RC-LH116 sönderdelas både RC QA och QB UQ, som deltar i elektronöverföring i laddningsseparationsprocessen, i sina bindningsställen. I RC-LH114-W har dock QB-kinon inte upplösts och kommer att diskuteras i detalj nedan. Förutom QA- och QB-kinoner är två kelerade UQ-molekyler (belägna mellan RC- och LH1-ringarna) allokerade i RC-LH114-W-strukturen enligt deras välupplösta huvudgrupper (belägna i Q1 respektive Q2). Figur 5C). Två isoprenenheter är tilldelade Q1, och densitetskartan upplöser de kompletta 10 isopren-svansarna i Q2. I strukturen för RC-LH116 upplöstes tre kelerade UQ10-molekyler (Q1 till Q3, figur 5D), och alla molekyler har en tydlig densitet genom hela svansen (figur 5, D till G). I de två strukturerna har positionerna för kinonhuvudgrupperna i Q1 och Q2 utmärkt konsistens (Figur S12F), och de interagerar endast med RC. Q1 är beläget vid ingången till W-gapet i RC-LH114-W (Figur 1G och 5, C, D och E), och Q2 är beläget nära QB-bindningsstället (Figur 5, C, D) och F). De konserverade L-Trp143- och L-Trp269-resterna ligger mycket nära Q1 och Q2 och ger potentiella π-staplingsinteraktioner (Figur 5, E och F, och Figur S12). L-Gln88, 3,0 Å från det distala syret i Q1, ger en stark vätebindning (Figur 5E); denna rest är konserverad i alla RC utom det mest avlägsna släktskapet (Figur S13). L-Ser91 är konservativt substituerad för Thr i de flesta andra RC (Figur S13), är 3,8 Ångström från metylsyret i Q1 och kan ge svaga vätebindningar (Figur 5E). Q3 verkar inte ha en specifik interaktion, men är belägen i den hydrofoba regionen mellan RC-M-subenheten och LH1-α-subenheten 5 till 6 (Figur 5, D och G). Q1, Q2 och Q3 eller närliggande kelaterade kinoner har också separerats i Tch. Gentle, Trv. Strain 970 och Blc. Irisstrukturen (9, 10, 12) pekar på ett konserverat hjälpkinonbindningsställe i RC-LH1-komplexet (Figur S12G). De fem delade UQ-värdena i RC-LH116 överensstämmer väl med 5,8 ± 0,7 för varje komplex bestämt med högpresterande vätskekromatografi (HPLC), medan de tre delade UQ-värdena i RC-LH114-W är lägre än. Det uppmätta värdet på 6,2 ± 0,3 (Fig. S14) indikerar att det finns olösta UQ-molekyler i strukturen.
De pseudosymmetriska L- och M-polypeptiderna innehåller vardera fem TMH:er och bildar en heterodimer som kombinerar en BChl-dimer, två BChl-monomerer, två bakteriofag (BPh)-monomerer och en icke-hemjärn- och en eller två UQ10-molekyler. Genom närvaron av vätebindningar på den terminala ketongruppen och dess kända ackumulering i Rps inkorporeras karotenoider i M-subenheten, som kallas cis-3,4-dehydroorhodopin. Arter (25). Den yttre membrandomänen hos RC-H är förankrad i membranet av en enda TMH. Den övergripande RC-strukturen liknar de tre subenheterna RC hos besläktade arter (såsom Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). Makrocyklerna hos BChl och BPh, karotenoidryggraden och icke-hemjärn överlappar varandra inom upplösningsområdet för dessa strukturer, liksom UQ10-huvudgruppen vid QA-stället och QB-kinonen vid RC-LH116 (Figur S15).
Tillgängligheten av två RC-strukturer med olika QB-ställesbeläggningsgrader ger en ny möjlighet att undersöka de konsekventa konformationsförändringarna som följer med QB-kinonbindning. I RC-LH116-komplexet är QB-kinon beläget i den helt bundna "proximala" positionen (26), men separationen av RC-LH114-W har inte QB-kinon. Det finns ingen QB-kinon i RC-LH114-W, vilket är förvånande eftersom komplexet är aktivt, mer än RC-LH116-komplexet med strukturellt upplöst QB-kinon. Även om de två LH1-ringarna kelerar cirka sex kinoner, är fem strukturellt upplösta i den slutna RC-LH116-ringen, medan endast tre är strukturellt begränsade i den öppna RC-LH114-W-ringen. Denna ökade strukturella störning kan återspegla den snabbare utbytet av RC-LH114-W QB-ställen, snabbare kinonkinetik i komplexet och ökad sannolikhet för att korsa LH1-slingan. Vi föreslår att avsaknaden av UQ i RC QB-stället för RC-LH114-W kan vara resultatet av ett mer komplext och mer aktivt komplex, och att QB-stället för RC-LH114-W omedelbart har frysts i UQ-omsättningen. Det specifika stadiet (ingången till QB-stället har stängts) återspeglar konformationen av denna aktivitet.
Utan QB sker den åtföljande rotationen av L-Phe217 till en position som är inkompatibel med UQ10-bindning, eftersom det kommer att orsaka en rumslig kollision med den första isoprenenheten i svansen (Figur 6A). Dessutom är de uppenbara huvudsakliga konformationsförändringarna uppenbara, särskilt helix de (kort helix i slingan mellan TMH D och E) där L-Phe217 förskjuts till QB-bindningsfickan och rotationen av L-Tyr223 (Figur 6A) för att bryta vätebindningen med M-Asp45-ramverket och stänga ingången till QB-bindningsstället (Figur 6B). Helix de vrids vid sin bas, Cα i L-Ser209 förskjuts med 0,33 Å, medan L-Val221Cα förskjuts med 3,52 Å. Det finns inga observerbara förändringar i TMH D och E, vilka är överlagrade i båda strukturerna (Figur 6A). Såvitt vi vet är detta den första strukturen i den naturliga RC som stänger QB-stället. En jämförelse med den kompletta (QB-bundna) strukturen visar att innan kinonen reduceras krävs en konformationsförändring för att den ska kunna komma in i kinonen. L-Phe217 roterar för att bilda en π-staplingsinteraktion med kinonhuvudgruppen, och helixen förskjuts utåt, vilket gör att skelettet av L-Gly222 och sidokedjan av L-Tyr223 kan bilda ett vätebindningsnätverk med en stabil vätebindningsstruktur (Figur 6, A och C).
(A) Överlappande tecknad bild av hologram (L-kedja, orange/M-kedja, magenta) och apo (grå) struktur, där nyckelresterna visas i form av en stavliknande representation. UQ10 representeras av en gul stapel. Den streckade linjen indikerar vätebindningarna som bildas i hela strukturen. (B och C) Ytrepresentationen av apolipoproteinet och hela ringstrukturen, med sidokedjesyret i L-Phe217 i blått respektive L-Tyr223 i rött. L-subenheten är orange; M- och H-subenheterna är inte färgade. (D och E) Apolipoprotein (D) och hela (E) RC QB-ställen [färglägg med (A) respektive] och Thermophilus thermophilus PSII (grön, blå med plastkinon; PDB ID: 3WU2) Rikta in (58).
Oväntat nog, även om flera strukturer av QB-bristfälliga RC utan LH1 är tillgängliga, har de konformationsförändringar som observerats i denna studie inte rapporterats tidigare. Dessa inkluderar QB-utarmningsstrukturen från Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) och Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), vilka alla är nästan desamma som deras övergripande QB-struktur. Noggrann inspektion av 3PRC visade att LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) detergentmolekyler binder vid ingången till QB-positionen, vilket kan förhindra omlagring till en sluten konformation. Även om LDAO inte sönderdelas vid samma position i 1EYS eller 1OGV, framställs dessa RC med samma detergent och kan därför ge samma effekt. Kristallstrukturen för Rba. Sphaeroides RC samkristalliserad med cytokrom c2 (PDB ID: 1L9B) verkar också ha ett slutet QB-ställe. I detta fall antar dock den N-terminala regionen av RC-M-polypeptiden (som interagerar med QB-bindningsstället genom H-bindningen i Tyr-resten på Q-helixen) en onaturlig konformation, och QB-konformationsförändringen utforskas inte ytterligare (30). Det som är betryggande är att vi inte har sett denna typ av deformation av M-polypeptiden i RC-LH114-W-strukturen, vilken är nästan densamma som den N-terminala regionen av RC-LH116 RC. Det bör också noteras att efter utrotningen av den detergentbaserade LH1-antennen upplöstes apolipoprotein-RC:erna i PDB, vilket eliminerade de interna kinonpoolerna och lipiderna i gapet mellan RC och den inre ytan av den omgivande LH1-ringen (31, 32). RC förblir funktionell eftersom den behåller alla kofaktorer, förutom den nedbrytbara QB-kinonen, som är mindre stabil och ofta förloras under beredningsprocessen (33). Dessutom är det känt att avlägsnandet av LH1 och naturliga cykliska lipider från RC kan påverka funktioner, såsom den förkortade livslängden för det laddningsseparerade P+QB-tillståndet (31, 34, 35). Därför spekulerar vi i att förekomsten av den lokala LH1-ringen som omger RC kan bibehålla det "stängda" QB-stället och därigenom bevara den lokala miljön nära QB.
Även om apolipoprotein (utan QB-kinon) och den fullständiga strukturen endast representerar två ögonblicksbilder av omsättningen av QB-stället, snarare än en serie händelser, finns det indikationer på att bindningen kan styras för att förhindra återbindning av hydrokinon för att hämma substrathämning. Interaktionen mellan kinolol och kinon nära apolipoproteinets QB-ställe kan vara annorlunda, vilket leder till att det avstöts av RC. Det har länge föreslagits att konformationsförändringar spelar en roll i bindningen och reduktionen av kinoner. Förmågan hos frysta RC att reducera kinoner efter mörkeradaption är försämrad (36); Röntgenkristallografi visar att denna skada beror på att QB-kinoner är fångade i en "distal" konformation cirka 4,5 Å från den aktiva proximala positionen (26, 37). Vi föreslår att denna distala bindningskonformation är en ögonblicksbild av mellanläget mellan apolipoprotein och den fullständiga ringstrukturen, vilket följer den initiala interaktionen med kinon och öppnandet av QB-stället.
Typ II-RC som finns i PSII-komplexet hos vissa fototrofa bakterier och cyanobakterier, alger och växter har strukturell och funktionell konservering (38). Den strukturella uppriktningen som visas i figur 6 (D och E) betonar likheten mellan PSII-RC och QB-stället i det bakteriella RC-komplexet. Denna jämförelse har länge varit en modell för att studera de närbesläktade systemen för kinonbindning och -reduktion. Tidigare publikationer antydde att konformationsförändringar åtföljs av PSII-reduktion av kinoner (39, 40). Med tanke på den evolutionära konserveringen av RC kan denna tidigare oobserverade bindningsmekanism därför också vara tillämplig på QB-stället för PSII RC i syresatta fototrofa växter.
Rps ΔpufW (omärkt pufW-deletion) och PufW-His (C-terminal 10x His-märkt protein-W uttryckt från det naturliga pufW-locuset) stammar. palustris CGA009 beskrevs i vårt tidigare arbete (16). Dessa stammar och den isogena vildtypsföräldern återvanns från frysen genom att stryka ett litet antal celler på PYE (vardera 5 g liter-1) (förvarad i LB vid -80 °C, innehållande 50 % (w/v) glycerol) protein, jästextrakt och succinat) agar [1,5 % (w/v)] platta. Plattan inkuberades över natten i mörker vid rumstemperatur under anaeroba förhållanden och belystes sedan med vitt ljus (~50 μmolm-2 s-1) från OSRAM 116-W halogenlampor (RS Components, Storbritannien) i 3 till 5 dagar tills en enda koloni uppstod. En enda koloni användes för att inokulera 10 ml M22+ medium (41) kompletterat med 0,1 % (w/v) kasaminosyror (nedan kallat M22). Kulturen odlades under syrefattiga förhållanden i mörker vid 34 °C med skakning vid 180 rpm i 48 timmar, och sedan inokulerades 70 ml av kulturen under samma förhållanden i 24 timmar. En semi-aerob kultur med en volym på 1 ml används för att inokulera 30 ml M22-medium i en 30 ml universalskruvkork transparent glasflaska och bestrålas med omrörning (~50 μmolm-2 s-1) i 48 timmar med en steril magnetisk omrörarstav. Därefter inokulerades 30 ml av kulturen med cirka 1 liter kultur under samma förhållanden, vilken sedan användes för att inokulera cirka 9 liter kultur belyst vid ~200 μmolm-2 s-1 i 72 timmar. Cellerna skördades genom centrifugering vid 7132 RCF i 30 minuter, resuspenderades i ~10 ml 20 mM tris-HCl (pH 8,0) och förvarades vid -20 °C tills de behövdes.
Efter upptining, tillsätt några kristaller av deoxiribonukleas I (Merck, Storbritannien), lysozym (Merck, Storbritannien) och två Roche holoenzymproteashämmartabletter (Merck, Storbritannien) till de resuspenderade cellerna. I en fransk tryckcell (Aminco, USA) med 20 000 psi tryck sönderdelades cellerna 8 till 12 gånger. Efter att ha avlägsnat obrutna celler och olösliga rester genom centrifugering vid 18 500 RCF i 15 minuter vid 4 °C, fälldes membranet ut från det pigmenterade lysatet genom centrifugering vid 113 000 RCF i 2 timmar vid 43 000 °C. Kassera den lösliga fraktionen och resuspendera det färgade membranet i 100 till 200 ml 20 mM tris-HCl (pH 8,0) och homogenisera tills det inte finns några synliga aggregat. Det suspenderade membranet inkuberades i 20 mM tris-HCl (pH 8,0) (Anatrace, USA) innehållande 2 % (w/v) β-DDM i 1 timme i mörker vid 4 °C under försiktig omrörning. Centrifugera sedan vid 70 °C för att lösa upp 150 000 RCF vid 4 °C i 1 timme för att avlägsna kvarvarande olösliga ämnen.
Det solubiliserande membranet från ΔpufW-stammen applicerades på en 50 ml DEAE Sepharose-jonbyteskolonn med tre kolonnvolymer (CV) bindningsbuffert [20 mM tris-HCl (pH 8,0) innehållande 0,03 % (w/v) β-DDM]. Tvätta kolonnen med två CV-bindningsbuffertar och tvätta sedan kolonnen med två bindningsbuffertar innehållande 50 mM NaCl. RC-LH116-komplexet eluerades med en linjär gradient av 150 till 300 mM NaCl (i bindningsbuffert) vid 1,75 CV, och det återstående bindningskomplexet eluerades med en bindningsbuffert innehållande 300 mM NaCl vid 0,5 CV. Samla in absorptionsspektrumet mellan 250 och 1000 nm, behåll fraktionen med absorbanskvoten (A880/A280) större än 1 vid 880 till 280 nm, späd ut den två gånger i bindningsbufferten och använd samma procedur igen på DEAE-kolonnen vid rening. Späd ut fraktionerna med A880/A280-förhållanden högre än 1,7 och A880/A805-förhållanden högre än 3,0, utför den tredje omgången jonbyte och behåll fraktionerna med A880/A280-förhållanden högre än 2,2 och A880/A805-förhållanden högre än 5,0. Det delvis renade komplexet koncentrerades till ~2 ml i ett Amicon 100 000 molekylviktsgränsvärde (MWCO) centrifugalfilter (Merck, Storbritannien) och laddades på en Superdex 200 16/600 storleksexklusionskolonn (GE Healthcare, USA) innehållande 200 mM NaCl-buffert, och eluerades sedan i samma buffert vid 1,5 CV. Samla in absorptionsspektra för storleksexklusionsfraktionen och koncentrera absorptionsspektra med A880/A280-förhållanden över 2,4 och A880/A805-förhållanden över 5,8 till 100 A880, och använd dem omedelbart för beredning eller lagring av kryo-TEM-nät. Förvara vid -80 °C tills det behövs.
Det solubiliserande membranet från PufW-His-stammen applicerades på en 20 ml HisPrep FF Ni-NTA Sepharose-kolonn (20 mM tris-HCl (pH 8,0) innehållande 200 mM NaCl och 0,03 % (vikt/vikt)) i IMAC-buffert (GE Healthcare). (v) β-DDM]. Kolonnen tvättades med fem CV IMAC-buffert och sedan med fem CV IMAC-buffert innehållande 10 mM histidin. Kärnkomplexet eluerades från kolonnen med fem IMAC-buffertar innehållande 100 mM histidin. Fraktionen innehållande RC-LH114-W-komplexet koncentrerades till ~10 ml i en omrörd tank utrustad med ett Amicon 100 000 MWCO-filter (Merck, Storbritannien), späddes 20 gånger med bindningsbuffert och tillsattes sedan till 25 ml. I DEAE Sepharose-kolonnen används fyra CV bundna till bufferten i förväg. Tvätta kolonnen med fyra CV-bindningsbuffertar, eluera sedan komplexet på åtta CV på en linjär gradient av 0 till 100 mM NaCl (i bindningsbuffert), och de återstående fyra CV:erna innehållande 100 mM bindningsbuffert. De återstående komplexen som eluerades på natriumklorid kombinerat med A880/A280-förhållandet högre än 2,4 och A880/A805-förhållandet högre än 4,6-fraktionerna koncentrerades till ~2 ml i ett Amicon 100 000 MWCO centrifugalfilter och fylldes med 1,5 CV IMAC i förväg. Buffertjämviktad Superdex 200 16/600 storleksexklusionskolonn eluterades sedan i samma buffert över 1,5 CV. Samla in absorptionsspektra för storleksexklusionsfraktionerna och koncentrera absorptionsspektra med A880/A280-förhållanden över 2,1 och A880/A805-förhållanden över 4,6 till 100 A880, vilka omedelbart används för beredning av frysta TEM-rutnät eller förvaras vid -80 °C tills de behövs.
En Leica EM GP-doppfrys användes för att framställa TEM-nät för låg temperatur. Komplexet späddes i IMAC-buffert till A880 av 50, och sedan laddades 5 μl på ett nyligen glimurladdat QUANTIFOIL 1.2/1.3 kolbelagt kopparnät (Agar Scientific, Storbritannien). Inkubera nätet vid 20 °C och 60 % relativ fuktighet i 30 sekunder, torka det sedan torrt i 3 sekunder och släck det sedan i flytande etan vid -176 °C.
Data från RC-LH114-W-komplexet registrerades på eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) med ett Titan Krios-mikroskop, som arbetar med en accelerationsspänning på 300 kV, med en nominell förstoring på 130 000× och en energi på 20 eV. Ett Gatan 968 GIF Quantum med K2-toppdetektor användes för att registrera bilder i räkneläge för att samla in data. Den kalibrerade pixelstorleken är 1,048 Å och doshastigheten är 3,83 e-Å-2s-1. Filmen samlades in på 11 sekunder och delade in den i 40 delar. Använd det kolbelagda området för att omfokusera mikroskopet och samla sedan in tre filmer per hål. Totalt samlades 3130 filmer in, med defokuseringsvärden mellan -1 och -3 μm.
Data för RC-LH116-komplexet samlades in med samma mikroskop vid Asterbury Biostructure Laboratory (University of Leeds, Storbritannien). Data samlades in i räkneläge med en förstoring på 130 k, och pixelstorleken kalibrerades till 1,065 Å med en dos på 4,6 e-Å-2s-1. Filmen spelades in på 12 sekunder och delades in i 48 delar. Totalt samlades 3359 filmer in, med defokuseringsvärden mellan -1 och -3 μm.
All databehandling utförs i Relion 3.0-pipelinen (42). Använd Motioncorr 2 (43) för att korrigera strålrörelsen genom dosviktning och använd sedan CTFFIND 4.1 (44) för att bestämma CTF-parametern (contrast transfer function). Typiska fotomikrofotografier efter dessa initiala bearbetningssteg visas i figur 2. S16. Den automatiska urvalsmallen genereras genom att manuellt välja cirka 250 pixlar av 1000 partiklar i en 250-pixelram och ingen referens tvådimensionell (2D) klassificering, varigenom de klassificeringar som uppfyller kraven för provkontaminering eller inte har några urskiljbara egenskaper förkastas. Därefter utfördes automatiskt urval på alla mikrofotografier, och RC-LH114-W var 849 359 partiklar och RC-LH116-komplexet var 476 547 partiklar. Alla utvalda partiklar har genomgått två omgångar av icke-referens 2D-klassificering, och efter varje körning förkastas de partiklar som uppfyller kolområdet, provkontaminering, inga uppenbara egenskaper eller starkt överlappande partiklar, vilket resulterar i 772 033 (90,9 %) respektive 359 678 (75,5 %). Partiklar används för 3D-klassificering av RC-LH114-W respektive RC-LH116. Den initiala 3D-referensmodellen genererades med hjälp av den stokastiska gradientdescentmetoden. Med hjälp av den initiala modellen som referens klassificeras de utvalda partiklarna i fyra kategorier i 3D. Med modellen i denna kategori som referens utförs 3D-förfining på partiklarna i den största kategorin, använd sedan det initiala 15 Å lågpassfiltret för att täcka lösningsmedelsområdet, lägg till 6 pixlar mjuka kanter och efterbehandla pixlarna för att korrigera Gatan K2-toppmoduleringsöverföringsfunktionen för den toppdetektorn. För RC-LH114-W-datasetet modifierades denna initiala modell genom att ta bort den starka densiteten vid maskens kanter (frikopplad från kärnkomplexdensiteten i UCSF Chimera). De resulterande modellerna (upplösningarna för RC-LH114-W och RC-LH116 är 3,91 respektive 4,16 Å) används som referens för den andra omgången av 3D-klassificering. De använda partiklarna grupperas i den initiala 3D-klassen och innehåller inte stark korrelation med grannskapet. Överlappning eller brist på uppenbara strukturella egenskaper. Efter den andra omgången av 3D-klassificering valdes kategorin med den högsta upplösningen [För RC-LH114-W är en kategori 377 703 partiklar (44,5%), för RC-LH116 finns det två kategorier, totalt 260 752 partiklar (54,7%), där de är desamma endast när de är justerade efter den initiala rotationen med en liten skillnad]. De utvalda partiklarna extraheras på nytt i en 400-pixelbox och förfinas genom 3D-förfining. Lösningsmedelsmasken genereras med hjälp av det initiala 15 Å lågpassfiltret, 3-pixelskartexpansion och 3-pixel mjukmask. Med hjälp av CTF-förfining per partikel, rörelsekorrigering per partikel och den andra omgången av CTF-förfining per partikel, utförs 3D-förfining, lösningsmedelsmaskning och efterbehandling efter varje steg för att ytterligare förfina den resulterande texturen. Med hjälp av FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) gränsvärde på 0,143 är upplösningarna för de slutliga modellerna av RC-LH114-W och RC-LH116 2,65 respektive 2,80 Å. FSC-kurvan för den slutliga modellen visas i figur 2. S17.
Alla proteinsekvenser är nedladdade från UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) användes för att konstruera en homologimodell av RC, som innehåller proteinsekvenserna för RC-L, RC-M och RC-H samt kristallstrukturen för Rba. sphaeroides RC användes som mall (PDB ID: 5LSE) (46). Använd verktyget "fit map" i UCSF Chimera för att anpassa den genererade modellen till kartan (47), förbättra proteinstrukturen och kofaktorn [4×BChl a (monomerbibliotekets restnamn = BCL), 2×BPh a (BPH), en eller två typer av UQ10 (U10), ett icke-hemjärn (Fe) och en 3,4-dihydrohexakarbonylkolin (QAK)] använd Coot (48) för att lägga till. Eftersom QAK inte är tillgängligt i monomerbiblioteket parametriserades det med hjälp av eLBOW-verktyget i PHENIX (49).
Därefter konstruerades LH1-subenheten. Inledningsvis användes det automatiska konstruktionsverktyget i PHENIX (49) för att automatiskt konstruera en del av LH1-sekvensen med hjälp av kartan och LH1-α- och LH1-β-proteinsekvenserna som indata. Välj den mest kompletta LH1-subenheten, extrahera den och ladda den i Coot, lägg manuellt till den saknade sekvensen i den och förfina manuellt hela strukturen innan du lägger till två BCl-enheter a (BCL) och ett spirilloxantin (CRT) [enligt relevant Rps. Densiteten för LH1-komplexet och det kända karotenoidinnehållet. Art (17)]. Kopiera den kompletta LH1-subenheten och använd UCSF Chimera "Docking Map Tool" för att docka i det angränsande icke-modellerade området med LH1-densitet och förfina den sedan i Coot; upprepa processen tills alla LH1-subenheter har modellerats. För RC-LH114-W-strukturen, genom att extrahera den oallokerade densiteten i Coot, segmenteras proteinet från de återstående icke-proteinkomponenterna i USCF Chimera-kartan och Autobuild-verktyget används för att etablera den initiala modellen och de återstående subenheterna (protein-W) Modellering. I PHENIX (49). Lägg till eventuella saknade sekvenser till den resulterande modellen i Coot (48), och förfina sedan manuellt hela subenheten. Den återstående oallokerade densiteten passar kombinationen av lipider (PDB-monomerbiblioteks-ID för CDL = CDL, POPC = 6PL och POPG = PGT), β-DDM-detergent (LMT) och UQ10-molekyler (U10). Använd PHENIX-optimering (49) och manuell optimering i Coot (48) för att finslipa den kompletta initialmodellen tills modellstatistiken och den visuella kvaliteten på anpassningen inte kan förbättras ytterligare. Slutligen, använd LocScale (50) för att skärpa den lokala kartan och utför sedan flera andra cykler för modellering av den oallokerade densiteten och automatisk och manuell optimering.
Respektive peptider, kofaktorer och andra lipider och kinoner dockade inom sina respektive densiteter visas i figur 1 och 2, S18 till S23. Den statistiska informationen för den slutliga modellen visas i tabell S1.
Om inget annat anges samlades UV/Vis/NIR-absorptionsspektra in på en Cary60-spektrofotometer (Agilent, USA) med 1 nm-intervall från 250 nm till 1000 nm och en integrationstid på 0,1 sekunder.
Späd provet i en kvartskyvett med en 2 mm våglängd till A880 på 1, och samla in absorptionsspektrumet mellan 400 och 1000 nm. De cirkulära dikroiska spektra samlades in på en Jasco 810 spektropolarimeter (Jasco, Japan) med 1 nm intervall mellan 400 nm och 950 nm med en skanningshastighet på 20 nm min-1.
Den molära extinktionskoefficienten bestäms genom att späda kärnkomplexet till en A880 på cirka 50. Späd ut 10 μl volym i 990 μl bindningsbuffert eller metanol och samla omedelbart in absorptionsspektrumet för att minimera BChl-nedbrytning. BChl-halten i varje metanolprov beräknades med extinktionskoefficienten vid 771 nm på 54,8 mM-1 cm-1, och extinktionskoefficienten bestämdes (51). Dividera den uppmätta BChl-koncentrationen med 32 (RC-LH114-W) eller 36 (RC-LH116) för att bestämma kärnkomplexkoncentrationen, vilken sedan används för att bestämma absorptionsspektrumet för samma prov som samlats in i bufferten parallellt. Tre upprepade mätningar gjordes för varje prov, och den genomsnittliga absorbansen för BChl Qy-maximum användes för beräkningen. Extinktionskoefficienten för RC-LH114-W mätt vid 878 nm är 3280 ± 140 mM-1 cm-1, medan extinktionskoefficienten för RC-LH116 mätt vid 880 nm är 3800 ± 30 mM-1 cm-1.
UQ10 kvantifierades enligt metoden i (52). Kortfattat utfördes omvänd fas-HPLC (RP-HPLC) med hjälp av Agilent 1200 HPLC-systemet. Lös upp cirka 0,02 nmol RC-LH116 eller RC-LH114-W i 50 μl 50:50 metanol:kloroform innehållande 0,02 % (vikt/volym) järnklorid och injicera den förjämviktade Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 mm Dissolve i 1 ml-1 min-1 vid 40 °C i HPLC-lösningsmedel (80:20 metanol:2-propanol) på en ×25 cm kolonn. Utför isokratisk eluering i ett HPLC-lösningsmedel för att övervaka absorbansen vid 275 nm (UQ10), 450 nm (karotenoider) och 780 nm (BChl) i 1 timme. Toppen i 275 nm-kromatogrammet vid 25,5 minuter integrerades, vilket inte innehöll några andra detekterbara föreningar. Den integrerade arean används för att beräkna den molära mängden UQ10 extraherad med hänvisning till kalibreringskurvan beräknad från injektion av rena standarder från 0 till 5,8 nmol (Figur S14). Varje prov analyserades i tre replikat, och det rapporterade felet motsvarar standardavvikelsen för medelvärdet.
En lösning innehållande RC-LH1-komplexet med en maximal Qy-absorption på 0,1 framställdes med 30 μM reducerat hästhjärtacytokrom c2 (Merck, Storbritannien) och 0 till 50 μMUQ2 (Merck, Storbritannien). Tre 1-ml prover framställdes vid varje UQ2-koncentration och inkuberades över natten i mörker vid 4 °C för att säkerställa fullständig anpassning till mörkret före mätning. Lösningen laddades i en OLIS RSM1000 modulär spektrofotometer utrustad med ett 300 nm flamma/500 linjegitter, 1,24 mm inlopp, 0,12 mm mitten och 0,6 mm utloppsslitsar. Ett 600 nm långt passfilter placeras vid ingången till provfotoröret och referensfotomultiplikatorröret för att utesluta excitationsljus. Absorbansen övervakades vid 550 nm med en integrationstid på 0,15 s. Excitationsljuset emitteras från en 880 nm M880F2 LED (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., Storbritannien) via en fiberoptisk kabel med 90 % intensitet via en DC2200-styrenhet (Thorlabs Ltd., Storbritannien) och emitteras till ljuskällan i en vinkel på 90°. Mätstrålen är vänd mot spegeln för att returnera eventuellt ljus som inte initialt absorberades av provet. Övervaka absorbansen i 10 sekunder innan belysningsstyrkan är 50 sekunder lång. Därefter övervakades absorbansen ytterligare i 60 sekunder i mörker för att bedöma i vilken utsträckning kinolol spontant reducerar cytokrom c23+ (se figur S8 för rådata).
Data bearbetades genom att anpassa en linjär initial hastighet inom 0,5 till 10 s (beroende på UQ2-koncentrationen) och medelvärdet av hastigheterna för alla tre prover vid varje UQ2-koncentration beräknades. RC-LH1-koncentrationen beräknad med respektive extinktionskoefficient användes för att omvandla hastigheten till den katalytiska effektiviteten, ritad i Origin Pro 2019 (OriginLab, USA), och anpassad till Michaelis-Menten-modellen för att bestämma de synbara Km- och Kcat-värdena.
För mätningar av transient absorption späddes RC-LH1-provet till ~2 μM i IMAC-buffert innehållande 50 mM natriumaskorbat (Merck, USA) och 0,4 mM terbutin (Merck, USA). Askorbinsyra används som offerelektrondonator och tert-butaklofen används som QB-hämmare för att säkerställa att den huvudsakliga RC-donatorn förblir reducerad (det vill säga inte fotooxiderad) under hela mätprocessen. Cirka 3 ml prov tillsätts till en specialanpassad roterande cell (cirka 0,1 m i diameter, 350 RPM) med en optisk väglängd på 2 mm för att säkerställa att provet i laservägen har tillräckligt med tid för mörkeranpassning mellan excitationspulserna. Använd ~100-fs laserpulser för att amplifiera Ti:Sapphire-lasersystemet (Spectra Physics, USA) för att excitera provet vid 880 nm med en repetitionsfrekvens på 1 kHz (20 nJ för NIR eller 100 nJ för Vis). Innan data samlas in, exponera provet för excitationsljus i cirka 30 minuter. Exponering kommer att orsaka QA-inaktivering (möjligen minskad QA en eller två gånger). Observera dock att denna process är reversibel eftersom RC efter en lång period av mörkeradaption långsamt återgår till QA-aktivitet. En Helios-spektrometer (Ultrafast Systems, USA) användes för att mäta transienta spektra med en fördröjningstid på -10 till 7000 ps. Använd Surface Xplorer-programvaran (Ultrafast Systems, USA) för att dela upp grupperna av datamängderna, sedan slå samman och standardisera. Använd programvarupaketet CarpetView (Light Conversion Ltd., Litauen) för att använda den kombinerade datamängden för att erhålla differentialspektra relaterade till avklingning, eller använd en funktion som faltar flera exponenter med instrumentets respons för att anpassa den spektrala utvecklingen med en våglängd i Origin (OriginLab, USA).
Som nämnts ovan (53) framställdes en fotosyntetisk film innehållande LH1-komplexet som saknade både RC- och perifer LH2-antenn. Membranet späddes i 20 mM tris (pH 8,0) och laddades sedan i en kvartskyvett med en 2 mm optisk våglängd. En 30 nJ laserpuls användes för att excitera provet vid 540 nm med en fördröjningstid på -10 till 7000 ps. Bearbeta datasetet som beskrivits för Rps. pal-provet.
Membranet pelleterades genom centrifugering vid 150 000 RCF i 2 timmar vid 4 °C, och sedan resuspenderades dess absorbans vid 880 nm i 20 mM tris-HCl (pH 8,0) och 200 mM NaCl. Lös upp membranet genom att långsamt röra om 2 % (w/v) β-DDM i 1 timme i mörker vid 4 °C. Provet späddes i 100 mM trietylammoniumkarbonat (pH 8,0) (TEAB; Merck, Storbritannien) till en proteinkoncentration av 2,5 mg ml-1 (Bio-Rad-analys). Vidare bearbetning utfördes från den tidigare publicerade metoden (54), med början i utspädningen av 50 μg protein till totalt 50 μl TEAB innehållande 1 % (w/v) natriumlaurat (Merck, Storbritannien). Efter sonikering i 60 sekunder reducerades det med 5 mM tris(2-karboxietyl)fosfin (Merck, Storbritannien) vid 37 °C i 30 minuter. För S-alkylering, inkubera provet med 10 mM metyl-S-metyltiometansulfonat (Merck, Storbritannien) och tillsätt det från en 200 mM isopropanolstamlösning i 10 minuter vid rumstemperatur. Proteolytisk digestion utfördes genom att tillsätta 2 μg trypsin/endoproteinas Lys-C-blandning (Promega Storbritannien) och inkubera vid 37 °C i 3 timmar. Laurat-surfaktanten extraherades genom att tillsätta 50 μl etylacetat och 10 μl 10 % (v/v) LC-kvalitet trifluorättiksyra (TFA; Thermo Fisher Scientific, Storbritannien) och virvla i 60 sekunder. Fasseparationen främjades genom centrifugering vid 15 700 RCF i 5 minuter. Enligt tillverkarens protokoll användes en C18-spinnkolonn (Thermo Fisher Scientific, Storbritannien) för att noggrant aspirera och avsalta den nedre fasen innehållande peptiden. Efter torkning med vakuumcentrifugering löstes provet i 0,5 % TFA och 3 % acetonitril, och 500 ng analyserades med nanoflow RP-kromatografi kopplad till masspektrometri med användning av de systemparametrar som beskrivits tidigare.
Använd MaxQuant v.1.5.3.30 (56) för proteinidentifiering och kvantifiering för att söka efter Rps. palustris proteomdatabasen (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Masspektrometriproteomikdata har deponerats i ProteomeXchange Alliance via PRIDE-partnerförvaret (http://proteomecentral.proteomexchange.org) under datasetidentifieraren PXD020402.
För analys med RPLC kopplat till elektrosprayjoniseringsmasspektrometri framställdes RC-LH1-komplexet från vildtyps-Rps. Med hjälp av den tidigare publicerade metoden (16) var proteinkoncentrationen som producerades i palustris-celler 2 mg ml-1 i 20 mM Hepes (pH 7,8), 100 mM NaCl och 0,03 % (w/v) β-(Bio-Rad-analys)) DDM. Enligt tillverkarens protokoll används ett 2D-reningskit (GE Healthcare, USA) för att extrahera 10 μg protein med utfällningsmetoden och lös upp fällningen i 20 μl 60 % (v/v) myrsyra (FA), 20 % (v/v) acetonitril och 20 % (v/v) vatten. Fem mikroliter analyserades med RPLC (Dionex RSLC) kopplat till masspektrometri (Maxis UHR-TOF, Bruker). Använd MabPac 1,2×100 mm kolonn (Thermo Fisher Scientific, Storbritannien) för separation vid 60 °C och 100 μl/min-1, med en gradient av 85 % (v/v) lösningsmedel A [0,1 % (v/v) FA och 0,02 % (V/v) TFA vattenlösning] till 85 % (v/v) lösningsmedel B [0,1 % (v/v) FA och 0,02 % (v/v) i 90 % (v/v) acetonitril TFA]. Med hjälp av en standardelektrosprayjoniseringskälla och standardparametrar i mer än 60 minuter erhåller masspektrometern 100 till 2750 m/z (massa-till-laddningsförhållande). Med hjälp av ExPASy bioinformatikresursportal FindPept-verktyget (https://web.expasy.org/findpept/), mappa masspektrumet till komplexets subenheter.
Cellerna odlades i 72 timmar under 100 ml NF-låg (10 μMm⁻² s⁻¹), medium (30 μMm⁻² s⁻¹) eller hög (300 μMm⁻² s⁻¹) ljus. M22-medium (M22-medium där ammoniumsulfat utelämnas och natriumsuccinat ersätts med natriumacetat) i en 100 ml skruvkorkflaska (23). I fem 30-sekunderscykler pärlades 0,1 mikron glaspärlor i volymförhållandet 1:1 för att lysera cellerna och kyldes på is i 5 minuter. Olösligt material, obrutna celler och glaspärlor avlägsnades genom centrifugering vid 16 000 RCF i 10 minuter i en bänkmikrocentrifug. Membranet separerades i en Ti 70.1-rotor med 100 000 RCF i 20 mM tris-HCl (pH 8,0) med en 40/15 % (w/w) sackarosgradient i 10 timmar.
Som beskrivits i vårt tidigare arbete, immunodetektion av His-taggen på PufW (16). Kort sagt, det renade kärnkomplexet (11,8 nM) eller membranet innehållande samma koncentration av RC (bestämt genom oxidation, subtraktion av det reducerade differensspektrumet och matchning av belastningen på den färgade gelen) i 2x SDS-laddningsbuffert (Merck, Storbritannien) späddes två gånger. Proteinerna separerades på en replika 12% bis-tris NuPage-gel (Thermo Fisher Scientific, Storbritannien). En gel färgades med Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, Storbritannien) för att ladda och visualisera RC-L-subenheten. Proteinet på den andra gelen överfördes till ett metanolaktiverat polyvinylidenfluorid (PVDF)-membran (Thermo Fisher Scientific, Storbritannien) för immunanalys. PVDF-membranet blockerades i 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,2 % (v/v) Tween-20 och 5 % (w/v) skummjölkspulver och inkuberades sedan med den primära anti-His-antikroppen (i Dilute the antibody buffer [50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl och 0,05 % (v/v) Tween-20] i 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, USA) i 4 timmar. Efter tvättning 3 gånger i 5 minuter i antikroppsbuffert kombinerades membranet med pepparrotsperoxidas (Sigma-Aldrich, Storbritannien) anti-mus sekundär antikropp (utspädd 1:10 000 i antikroppsbuffert). Inkubera för att möjliggöra detektion (5 minuter efter 3 tvättar i antikroppsbuffert) med användning av WESTAR ETA C 2.0 kemiluminescenssubstrat (Cyanagen, Italien) och Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Storbritannien).
Genom att rita intensitetsfördelningen för varje färgad gel eller immunanalysbana, integrera arean under toppen och beräkna intensitetsförhållandet mellan RC-L (färgad gel) och Protein-W (immunanalys), bearbeta bilden i ImageJ (57). Dessa förhållanden omvandlades till molära förhållanden genom att anta att förhållandet mellan RC-L och protein-W i det rena RC-LH114-W-provet var 1:1 och normalisera hela datamängden i enlighet därmed.
För kompletterande material till den här artikeln, se http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Detta är en artikel med öppen åtkomst som distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution-licensen. Artikeln tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i vilket medium som helst under förutsättning att originalverket citeras korrekt.
Obs: Vi ber dig bara att ange din e-postadress så att personen du rekommenderar till sidan vet att du vill att de ska se e-postmeddelandet och att det inte är skräppost. Vi kommer inte att samla in några e-postadresser.
Den här frågan används för att testa om du är en besökare och förhindra automatisk spam.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Den högupplösta strukturen hos ljusfälla 1-komplexet i reaktionscentret ger nya insikter i kinondynamiken.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Den högupplösta strukturen hos ljusfälla 1-komplexet i reaktionscentret ger nya insikter i kinondynamiken.
©2021 American Association for the Advancement of Science. alla rättigheter reserverade. AAAS är partner till HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef och COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.